淀粉酶活力測(cè)定

1、淀粉酶活力的測(cè)定一、目的學(xué)習(xí)和掌握測(cè)定淀粉酶包括a-淀粉酶和B-淀粉酶活力的原理和方法.二、原理淀粉是植物最主要的貯藏多糖,也是人和動(dòng)物的重要食物和發(fā)酵工業(yè)的根本原料.淀粉經(jīng)淀粉酶作用后生成葡萄糖、麥芽糖等小分子物質(zhì)而被機(jī)體利用.淀粉酶主要包括a-淀粉酶和B-淀粉酶兩種.a-淀粉酶可隨機(jī)地作用于淀粉中的a-1,4-糖甘鍵,生成葡萄糖、 麥芽糖、 麥芽三糖、 糊精等復(fù)原糖,同時(shí)使淀粉的粘度降低,因此又稱(chēng)為液化酶.B-淀粉酶可從淀粉的非復(fù)原性末端進(jìn)行水解,每次水解下一分子麥芽糖,又被稱(chēng)為糖化酶.淀粉酶催化產(chǎn)生的這些復(fù)原糖能使3,5-二硝基水楊酸復(fù)原,生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸,其反響如下

2、：淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的復(fù)原糖的量成正比.用標(biāo)準(zhǔn)濃度的麥芽糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,用比色法測(cè)定淀粉酶作用于淀粉后生成的復(fù)原糖的量,以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力.淀粉酶存在于幾乎所有植物中,特別是萌發(fā)后的禾谷類(lèi)種子,淀粉酶活力最強(qiáng),其中主要是a-淀粉酶和B-淀粉酶.兩種淀粉酶特性不同,a-淀粉酶不耐酸,在以下迅速鈍化.B-淀粉酶不耐熱,在70c15min鈍化.根據(jù)它們的這種特性,在測(cè)定活力時(shí)鈍化其中之一,就可測(cè)出另一種淀粉酶的活力.本實(shí)驗(yàn)采用加熱的方法鈍化B-淀粉酶,測(cè)出a-淀粉酶的活力.在非鈍化條件下測(cè)定淀粉酶總活力a-淀粉酶活力+B-淀粉酶活力,再減去a-淀粉酶的活力,

3、就可求出B-淀粉酶的活力.三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑萌發(fā)的小麥種子芽長(zhǎng)約icm2 .儀器1離心機(jī)2離心管3研缽4電爐5容量瓶：50mL1,100mLX16恒溫水浴720mL具塞刻度試管X138試管架9刻度吸管：2mLX3,1mLX2,10mLX110分光光度計(jì)3.試劑均為分析純1標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液 1mg/mL:精確稱(chēng)取100m皺芽糖,用蒸儲(chǔ)水溶解并定容至100mL（2）3,5-二硝基水楊酸試劑：精確稱(chēng)取3,5-二硝基水楊酸1g,溶于20mL2mol/LNaOH溶液中,參加50mL蒸儲(chǔ)水,再參加30g灑石酸鉀鈉,待溶解后用蒸儲(chǔ)水定容至100mL蓋緊瓶塞,勿使CO進(jìn)入.假設(shè)溶液混濁可過(guò)濾后使用.（

4、3）L的檸檬酸緩沖液A液：L檸檬酸：稱(chēng)取GHO凡O21.01g,用蒸儲(chǔ)水溶解并定容至1L.B液：L檸檬酸鈉：稱(chēng)取NaGHO-2H2O29.41g,用蒸儲(chǔ)水溶解并定容至1L.取A液55mL與B液145mL混勻,既為的檸檬酸緩沖液.（4）1%S粉溶液：稱(chēng)取1g淀粉溶于100mLL的檸檬酸緩沖液中.四、操作步驟1 .麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7支干凈的具塞刻度試管,編號(hào),按表1參加試劑:試劑管號(hào)1234567麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液mD0蒸儲(chǔ)水mD0麥芽糖含量m03,5-二硝基水楊酸mD搖勻,置沸水浴中煮沸5min.取出后流水冷卻,加蒸儲(chǔ)水定容至20mL以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn),在540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定光密度.以麥

5、芽糖含量為橫坐標(biāo),光密度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.2 .淀粉酶液的制備稱(chēng)取1g萌發(fā)3天的小麥種子芽長(zhǎng)約1cnj,置于研缽中,參加少量石英砂和2mL蒸儲(chǔ)水,研磨勻漿.將勻漿倒入離心管中,用6mL蒸儲(chǔ)水分次將殘?jiān)慈腚x心管.提取液在室溫下放置提取1520min,每隔數(shù)分鐘攪動(dòng)1次,使其充分提取.然后在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min,將上清液倒入100mL容量瓶中,加蒸儲(chǔ)水定容至刻度,搖勻,即為淀粉酶原液,用于a-淀粉酶活力測(cè)定.吸取上述淀粉酶原液10mL放入50mL容量瓶中,用蒸儲(chǔ)水定容至刻度,搖勻,即為淀粉酶稀釋液,用于淀粉酶總活力的測(cè)定.2.酶活力的測(cè)定：取6支干凈的試管,編號(hào),按表2進(jìn)

6、行操作.B-淀粉酶活力=a+P淀粉酶總活力a-淀粉酶活力酶活力測(cè)定取樣表a-淀粉酶活力測(cè)定3-淀粉酶活力測(cè)定I-1I-2I-3n-4n-5n-6淀粉酶原液mD預(yù)保溫將各試管和淀粉溶液置于40c恒溫水浴中保溫10min1%粉溶液mD保溫在40c恒溫水浴中準(zhǔn)保證溫5min3,5-二硝基水楊酸mD0將各試管搖勻,顯色后進(jìn)行比色測(cè)定光密度,記錄測(cè)定結(jié)果,操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線五、結(jié)果計(jì)算計(jì)算I-2、I-3光密度平均值與I-1光密度之差,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量m.,按以下公式計(jì)算a-淀粉酶的活力.a-淀帶酯活力變芽糖毫克數(shù)/樣品鮮市幻,5分鐘_麥芽糖含狀淀粉的原液總體積遼樣品承耳計(jì)算n-2、n-3光密

7、度平均值與n-1光密度之差,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量m.,按下式計(jì)算a+B淀粉酶總活力.C卻商淀粉除總活力麥芽糖毫克數(shù)/樣品鮮重g 5分鐘二龍芽糖含玳mg乂淀粉原液總體枳稀釋倍數(shù)六、附注操作工程鈍化3-淀粉酶淀粉酶稀釋液mD03,5-二硝基水楊酸mD置70c水浴15min,冷卻00000.0(1)樣品提取液的定容體積和酶液稀釋倍數(shù)可根據(jù)不同材料酶活性的大小而定.(2)為了保證酶促反響時(shí)間的準(zhǔn)確性,在進(jìn)行保溫這一步驟時(shí),可以將各試管每隔一定時(shí)間依次放入恒溫水浴,準(zhǔn)確記錄時(shí)間,到達(dá)5min時(shí)取出試管,立即參加3,5-二硝基水楊酸以終止酶反響,以便盡量減小因各試管保溫時(shí)間不同而引起的誤差.同時(shí)恒溫水浴溫度變化應(yīng)不超過(guò)土0.5C.(3)如果條件允許,各實(shí)驗(yàn)小組可采用不同材料,例如萌發(fā)1d、2d、3d、4d的小麥種子,比擬測(cè)定結(jié)果,以了解萌發(fā)過(guò)程中這兩種淀粉酶活性的變化.七、思考題1 .為什么要將I-1、I-2、I-3號(hào)試管中的淀粉酶原液置70c水浴中保溫15min?2.為什么要將各試管中的淀粉酶原液和1崛粉溶液分別置于40c水浴中保溫？1.由于B-淀粉酶不耐熱,70C15min被鈍化,所以將此3個(gè)試管中的溶液在70c保溫15m