牛磺酸對(duì)大鼠肢體缺血再灌注后肝臟損傷的保護(hù)效應(yīng)

1、?；撬釋?duì)大鼠肢體缺血再灌注后肝臟損傷的保護(hù)效應(yīng)           作者：王銀環(huán)，董淑云，張娜，趙利軍，李宏杰，孔小燕，劉麗華，張連元 【關(guān)鍵詞】  再灌注損傷；肝功能；四肢；?；撬酨rotective effect of taurine against liver injury after limb ischemiareperfusion in rats【Abstract】 AIM: To observe the liver injury and investigate the pr

2、otective  effect of taurine on the liver function after limb ischemiareperfusion.  METHODS: Thirty Wistar rats were randomly divided into control group，ischemiareperfusion(IR) group and taurine + ischemiareperfusion (TR) group (n=10 per group). The values of XOD, LDH, MDA, AST, ALT and SOD

3、 in plasma were respectively measured after 4 h limb ischemia  and 4 h reperfusion  in each group. XOD, MDA, ROS, MPO and Ca2+ in the liver tissues and GSHPX, Ca2+ in the liver mitochondria were observed. RESULTS:  In IR group compared with the control group, the values of LDH (190.16

4、±13.36) kat/L vs (122.39±14.87) kat/L, XOD (758.82±151.53)  nkat/L vs (543.61±43.51) nkat/L, MDA (5.19±0.67) nmol/L vs  (1.27±0.21) nmol/L , ALT (78.40±6.45) nkat/L vs  (20.50±3.70)  nkat/L, AST (47.70±4.47) nkat/L vs (25.25±2.98)

5、 nkat/L  in plasma increased, but SOD (1.30±0.15) kat/L vs (1.80±0.16) kat/L   reduced, XOD (104.69±12.34) kat/kg vs (59.01±10.50) kat/kg, MDA (2.66±0.08) nmol/L vs (1.29±0.14) nmol/L, ROS (771.65±100.69) kat/L vs (606.45±52.01) kat/L, MPO (0.47±

6、;0.04 vs 0.28±0.06), Ca2+(0.248±0.050) mmol/L vs (0.123±0.014) mmol/L in the liver tissues increased, GSHPx (20.34±4.67) nkat/L vs (31.17±11.50) nkat/L in the liver mitochondria  were obviously reduced, but Ca2+(0.38±0.06) mmol/L vs (0.14±0.03) mmol/L increase

7、d; In TR group compared with the IR group, the values of LDH (158.29±4.87) kat/L, XOD (758.82±151.53)  nkat/L, MDA (2.81±0.19)  nmol/L, ALT (64.40±9.05)  nkat/L, AST (38.70±8.10) nkat/L were  reduced, but SOD (1.50±0.17)  kat/L in plasma of TR g

8、roup increased;  the values of XOD (94.19±13.50) kat/L, MDA (1.67±0.12) nmol/L, ROS (710.81±55.34) kat/ L, MPO (0.36±0.04), Ca2+ (0.192±0.426)  mmol/L in the liver tissues decreased, the values of GSHPx(22.50±3.17)  nkat/L in the liver mitochondria of TR

9、group  obviously increased, but Ca2+ (0.31±0.06) mmol/L reduced. CONCLUSION: The taurine could protect the liver function of  rats after limb ischemiareperfusion.【Keywords】 reperfusion injury; liver function; extremities; taurine【摘要】目的： 觀察大鼠肢體缺血再灌注后肝臟的損傷性變化，以及牛磺酸對(duì)肝臟損傷性變化的保護(hù)效應(yīng)，探討?；撬釋?duì)大鼠

10、肢體缺血再灌注后肝臟功能保護(hù)作用的可能機(jī)制. 方法： 實(shí)驗(yàn)用Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照(control, C)組，缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR)組和?；撬?缺血再灌注(taurine+ ischemia reperfusion, TR)組，每組10只. 觀察缺血4 h再灌注4 h各組大鼠血漿中XOD, LDH, MDA, AST, ALT和SOD的變化；觀察肝組織XOD, MDA, ROS, MPO和Ca2+的變化；觀察肝線粒體GSHPX和Ca2+的變化. 結(jié)果： 單純肢體缺血再灌注組大鼠血漿中LDH (190.16±13.36) kat/L

11、,  XOD (758.82±151.53) nkat/L, MDA (5.19±0.67) nmol/L, ALT (78.40±6.45) nkat/L, AST (47.70±4.47) nkat/L 等較正常對(duì)照組血漿中LDH(122.39±14.87) kat/L, XOD(543.61±43.51) kat/kg, MDA(1.27±0.21) nmol/L, ALT(20.50±3.70) nkat/L, AST(25.25±2.98) nkat/L明顯增加，而SOD（1.30&#

12、177;0.15) kat/L較對(duì)照組 (1.80±0.16) kat/L明顯降低；單純肢體缺血再灌注組大鼠肝組織XOD (104.69±12.34) kat/Kg, MDA (2.66±0.08) nmol/L, ROS (771.65±100.69) kat/ L, MPO (0.47±0.04), Ca2+ (0.248±0.050) mmol/L較正常對(duì)照組肝組織XOD(59.01±10.50) kat/kg, MDA (1.29±0.14) nmol/L,  ROS (606.45±5

13、2.01) kat/L, MPO(0.28±0.06), Ca2+ (0.123±0.014) mmol/L 均明顯增加；缺血再灌注組大鼠肝線粒體GSHPx活性(20.34±4.67) nkat/L與正常對(duì)照組(31.17±11.50) nkat/L比較明顯降低，而Ca2+濃度(0.38±0.06) mmol/L則高于正常對(duì)照組(0.14±0.03) mmol/L. 牛磺酸+缺血再灌注組大鼠血漿中LDH(158.29±4.87) kat/L, XOD (758.82±151.53)  nkat/L, MD

14、A (2.81±0.19) nmol/L, ALT (64.40±9.05) nkat/L, AST (38.70±8.10) nkat/L較單純?nèi)毖俟嘧⒔M明顯降低，而SOD (1.50±0.17) kat/L則增加；肝組織XOD(94.19±13.50) kat/L,  MDA (1.67±0.12) nmol/L, ROS (710.81±55.34) kat/L,  MPO (0.36±0.04), Ca2+ (0.192±0.426) mmol/L等指標(biāo)也較單純?nèi)毖俟嘧⒔M明

15、顯降低，此外牛磺酸+缺血再灌注組大鼠肝線粒體GSHPx活性(22.50±3.17) nkat/L與單純肢體缺血再灌注組相比明顯增加，而Ca2+濃度(0.31±0.06) mmol/L則降低，損傷減輕. 結(jié)論： ?；撬峥梢詼p輕大鼠肢體缺血4 h再灌注4 h后所致的肝損傷.【關(guān)鍵詞】 再灌注損傷；肝功能；四肢；?；撬?引言?；撬崾求w內(nèi)含量最豐富的氨基酸，具有廣泛的生物學(xué)作用1. 已有很多實(shí)驗(yàn)資料2-6證明?；撬峋哂星宄杂苫涂怪|(zhì)過氧化作用等. 本實(shí)驗(yàn)我們?cè)诖笫笾w缺血再灌注模型上觀察肝臟的損傷性變化以及觀察預(yù)先給予?；撬釋?duì)這一變化的影響，旨在探討肢體缺血再灌注時(shí)遠(yuǎn)隔器官損傷

16、及其可能的發(fā)生機(jī)制，以及牛磺酸的保護(hù)效應(yīng)，為避免或延緩肢體缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展提供理論依據(jù).1材料和方法1.1材料健康雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量（250±50）g，購(gòu)自河南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，醫(yī)動(dòng)字： D410116號(hào)）；所用生化測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物制品公司，其余所需試劑均為市售分析純產(chǎn)品，722分光光度計(jì)購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器公司，低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Hittech公司. 1.2方法1.2.1模型復(fù)制采用本室常規(guī)方法7制作大鼠肢體缺血再灌注模型，乙醚淺麻醉下用橡皮圈環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢根部，阻斷血流4 h后松解，恢復(fù)血流灌注4 h，自腹主動(dòng)脈取血處死

17、動(dòng)物，并收集血液，4, 3500 r離心15 min，取血漿，裝入干凈的Epperdorf管，-70保存. 1.2.2動(dòng)物分組將實(shí)驗(yàn)大鼠分籠喂養(yǎng)30 d，術(shù)前12 h禁食，自由飲水，室溫（25±2），濕度40%50%. 隨機(jī)分為3組，每組10只， 正常對(duì)照組： 常規(guī)飼養(yǎng)，雙后肢松弛環(huán)繞橡皮圈，不阻斷血流，余操作同缺血再灌注組組.  缺血再灌注組： 常規(guī)飼養(yǎng)，按模型操作. 牛磺酸+缺血再灌注組： 在缺血再灌注前30 d每天灌服?；撬嵋淮?，劑量為200 mg/kg體質(zhì)量，其余操作同缺血再灌注組. 1.3觀測(cè)指標(biāo)1.3.1血漿生化指標(biāo)測(cè)定取血漿測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶（

18、ALT）,谷丙轉(zhuǎn)氨酶（AST）,乳酸脫氫酶（LDH）,黃嘌呤氧化酶（XOD）,丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）的含量. 1.3.2肝組織及其線粒體生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)，迅速取出肝組織，液氮速凍后-70保存. 取部分肝組織制成10%勻漿，測(cè)定黃嘌呤氧化酶（XOD）,丙二醛（MDA）,髓過氧化物酶（MPO）,活性氧（ROS）及Ca2+含量；測(cè)定線粒體中GSHPX和Ca2+含量. ALT, AST, LDH, XOD, MDA, MPO, ROS, GSHPX和Ca2+用比色法測(cè)定；肝線粒體的制備參照文獻(xiàn)8進(jìn)行. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 結(jié)果以x±s表示，用SPSS 11.5

19、統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方法分析以及SNKq檢驗(yàn).2結(jié)果2.1各組大鼠血漿ALT, AST, LDH, XOD, MDA和SOD含量的變化與正常對(duì)照組比較，單純?nèi)毖俟嘧⒔MMDA, XOD, ALT, AST和LDH均明顯升高，分別升高了3.09倍,39.6%, 2.82倍, 88.9%和55.4%,（P<0.05）；而SOD則降低了27.7%，(P<0.05)；?；撬?缺血再灌注組組與單純?nèi)毖俟嘧⒔M比較，MDA, XOD, ALT, AST和LDH分別降低了45.9%, 7.2%, 15.3%, 18.9%和16.8%，(P<0.05)；而SOD則升高了14.8%（P<

20、;0.05），損傷減輕（表1）.表1各組大鼠血漿SOD, XOD, ALT, AST, LDH和MDA含量(略)百事通 aP<0.05 vs bP<0.01正常對(duì)照， cP<0.05 vs缺血再灌注.2.2各組大鼠肝組織中XOD, MDA, MPO, ROS和Ca2+含量變化與正常對(duì)照組比較，單純?nèi)毖俟嘧⒔MXOD, MDA, ROS, MPO, LDH和Ca2+均明顯升高，分別升高了77.4%, 1.06倍, 27.2%, 66.8%, 30.1%和1.02倍，（P<0.05）；牛磺酸+缺血再灌注組與單純?nèi)毖俟嘧⒔M比較，XOD, MDA, ROS, MPO, LDH

21、和Ca2+分別降低了10.0%, 37.2%, 7.9%, 11.7%, 24.8% (P<0.05)和22.6% (P<0.05)，損傷減輕(表2). 表2各組大鼠肝組織XOD, MDA, ROS, MPO和Ca2+含量(略)aP<0.05 vs正常對(duì)照組;  cP<0.05 vs缺血再灌注組.2.3各組大鼠肝線粒體中GSHPX活性和Ca2+含量變化單純?nèi)毖俟嘧⒔M與正常對(duì)照組比較，Ca2+(0.38±0.06 vs 0.14±0.03) mmol/L明顯升高，升高1.71倍（P<0.05）；而GSHPX(20.34

22、77;4.67 vs 31.17±11.50) nkat/L則降低了34.8%, （P<0.05）；與單純?nèi)毖俟嘧⒔M比較，?；撬?缺血再灌注組Ca2+(0.31±0.06 mmol)降低了18.4% （P<0.05），而GSHPX(22.50±3.17 nkat/L)則升高了10.7% （P<0.05），損傷減輕.3討論大量研究證實(shí)組織缺血缺氧后的損傷不僅發(fā)生在缺氧當(dāng)時(shí)，更主要的是發(fā)生在缺血組織迅速恢復(fù)血供時(shí)9. 肝臟損傷是肢體缺血再灌注致遠(yuǎn)隔器官損傷的一個(gè)非常重要的臟器損傷. 反映肝功能的ALT, AST和反映脂質(zhì)過氧化損傷的XOD

23、是三個(gè)很重要的酶. 當(dāng)肝在受到損傷的早期，血清ALT, AST含量即可升高，是評(píng)價(jià)肝功能的非常重要的指標(biāo). XOD是氧自由基產(chǎn)生的主要酶. 在肝細(xì)胞受損時(shí)，此酶活性明顯升高. SOD和GSHPx對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基，防止膜脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)所造成的損傷，保護(hù)細(xì)胞. MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是衡量機(jī)體組織過氧化損傷程度的指標(biāo). LDH也屬于胞質(zhì)酶，其血漿水平的高低可反映組織受損的嚴(yán)重程度. MPO是中性粒細(xì)胞（PMN）嗜天青顆粒中含量較高的酶，組織中MPO活性的高低可定量表示組織中PMN聚集的程度. 在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，大鼠肢體缺血再灌

24、注后肝組織中MPO含量升高，表明PMN在肝內(nèi)血管黏附、聚集或游出到間質(zhì)增多，進(jìn)而促使黃嘌呤脫氫酶大量轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，引起“呼吸爆發(fā)”，產(chǎn)生大量氧自由基. 同時(shí)，由于SOD及GSHPx活性降低，清除自由基能力下降，自由基大量堆積，引發(fā)過氧化反應(yīng)，肝組織受到損傷. 由于細(xì)胞膜遭到破壞，通透性增加，致胞質(zhì)酶和溶酶體酶漏出，造成組織和細(xì)胞的進(jìn)一步損傷10. 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到的血漿中LDH, ALT, AST升高就是由于細(xì)胞膜通透性升高，酶釋放入血所致. 組織的過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，主要表現(xiàn)為MDA增多. 這些改變又加重了組織細(xì)胞損傷，形成自由基增多與組織損傷之間的“惡性循環(huán)”. ?；撬崾求w內(nèi)含量最豐富的氨基酸，具有廣泛的生物學(xué)作用1. 具有穩(wěn)定細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和抗脂質(zhì)過氧化作用11，是機(jī)體內(nèi)源性抗損傷和細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)，可明顯減輕肢體缺血再灌注后的細(xì)胞壞死12. 本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到灌服?；撬岬拇笫笾w缺血再灌注后，肝細(xì)胞損傷程度明顯減輕，同時(shí)SOD， GSHPx活性增加. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：?；撬崮軠p輕肢體缺血再灌注后繼發(fā)的肝臟損傷，而這一效應(yīng)與其避免或減輕肢體缺血再灌注后機(jī)體的過氧化反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān). 它的這一作用對(duì)保護(hù)機(jī)體避免或延緩肢體缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展有一定的意義. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：牛磺酸可能通過提高LIR后