核轉(zhuǎn)錄因子κB與腦缺血再灌注損傷

1、核轉(zhuǎn)錄因子B與腦缺血再灌注損傷    【關(guān)鍵詞】  腦缺血NFkappa B and cerebral ischemia reperfusion    腦缺血再灌注損傷（CIRI）是由興奮性（氨基酸）中毒、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡（AP）等多種因素參與的病理過(guò)程1。以往對(duì)CIRI機(jī)制的研究主要集中在氧化應(yīng)激、興奮性（氨基酸）中毒、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等方面，近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)CIRI與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡也有著密切的關(guān)系。CIRI中炎癥細(xì)胞和炎癥分子起了關(guān)鍵的作用，而可以調(diào)節(jié)多種炎癥分子轉(zhuǎn)錄并

2、能引起靶基因表達(dá)增加的核轉(zhuǎn)錄因子B（NFB）起著重要的調(diào)控作用。同時(shí)CIRI后細(xì)胞凋亡的發(fā)生又是一個(gè)由基因調(diào)節(jié)的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，多種基因產(chǎn)物的主動(dòng)表達(dá)在CIRI后細(xì)胞凋亡的發(fā)生過(guò)程中起保護(hù)或損傷作用；另外，NFB作為前凋亡因子或抗凋亡因子以不同的組合形式與某些凋亡相關(guān)基因結(jié)合對(duì)CIRI又有著不同的影響。1  NFB的生物學(xué)特性1.1  NFB的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)NFB屬于Rel蛋白家族，是由兩種Rel家族亞基：RelA（p65）、RelB、cRel和NFB1（p50/p105）、NFB2（p52）中任意兩種NFBRel蛋白亞單位構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)均具有能與DNA結(jié)合的特

3、性，又稱DNA結(jié)合亞單位，其中發(fā)揮主要生理功能的是p50與p65構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，NFB與其抑制蛋白（Inhibitory Kappa B，IB）以非活性的配體結(jié)合存在于胞漿中而沒(méi)有活性。1.2  NFB的活化信號(hào)目前已發(fā)現(xiàn)多種因素可以誘導(dǎo)NFB的活化，主要包括：（1）外源性因素，包括紫外線、電離輻射、細(xì)胞毒性藥物、微生物病原體及脂多糖等。（2）內(nèi)源性因素，包括細(xì)胞因子（腫瘤壞死因子、IL1、淋巴毒素）、炎癥介質(zhì)（血小板活化因子、白三烯、活性氧簇）、生長(zhǎng)因子（IL2、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、血小板衍生的生長(zhǎng)因子）、免疫相關(guān)受體（CD3、CD18、TCR等）及氧化

4、應(yīng)激等。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的NFB活化信號(hào)可分兩類：第一類與上述活化信號(hào)類似；第二類為中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異的NFB活化信號(hào)，如去極化、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子及一些神經(jīng)毒素刺激等。1.3  NFB的激活途徑NFB的激活途徑主要為：（1）在大多數(shù)細(xì)胞中，NFB二聚體與IB結(jié)合成三聚體。IB覆蓋于NFB的核定位信號(hào)區(qū)（nuclear localization sequence，NLS），使之以無(wú)活性形式存在于胞漿中。細(xì)胞受到活化信號(hào)刺激后，由活化信號(hào)誘導(dǎo)激活的IB激酶（IB Kinase，IK）引起IB蛋白第32和36位絲氨酸的磷酸化，磷酸化的IB 則由泛素蛋白在多個(gè)位點(diǎn)形成泛素化。最后，泛素化的

5、IB被26S蛋白酶水解降解，暴露出Rel蛋白上的NlS，這樣就使NFB快速易位進(jìn)入核內(nèi)，與DNA特定序列結(jié)合，引起靶基因表達(dá)增加2。（2）在細(xì)胞核內(nèi)水平，通過(guò)p65亞單位磷酸化引起NFB結(jié)構(gòu)改變而調(diào)節(jié)NFB的轉(zhuǎn)錄活性。（3）NFB的不典型激活途徑，即IK獨(dú)立的激活途徑。1.4  NFB的靶基因NFB誘導(dǎo)表達(dá)的靶基因有：（1）細(xì)胞因子，包括TNFa、IL1、IL2、IL3、IL6、IL8、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞集落刺激因子；（2）粘附分子，包括血管細(xì)胞粘附分子1（VCAM1）、細(xì)胞間粘附分子1（ICAM1）、內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞粘附分子1（IIAM1）；（3）急性期蛋白，如C反應(yīng)蛋白（

6、CRP）、血管緊張素；（4）受體，包括MHC1、血小板激活因子受體、組織因子（TF）、免疫球蛋白輕鏈；（5）酶，如COX2（可誘導(dǎo)環(huán)氧化酶2）、線粒體抗氧化酶；（6）趨化因子，如單核細(xì)胞趨化因子1、MIP、MCP；（7）參與細(xì)胞循環(huán)及凋亡的蛋白，包括cmyc、p53、Rb、TRAF1（TRADDTNFRassociated factor 1）、TRAF2、凋亡抑制蛋白（tAPs 如cIAP1 cIAP2）、抗凋亡的Bcl2蛋白家族成員；（8）其他如可誘導(dǎo)一氧化氮合酶（NOS）。對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用的有：tAPs、錳超氧化物歧化酶（MnSOD）以及抗凋亡的Bcl2蛋白家族成員、粘附分子ICAM1、

7、NOS等3。1.5  NFB的活化反饋調(diào)節(jié)NFB活化反饋調(diào)節(jié)有兩種途徑：（1）經(jīng)細(xì)胞外的正反饋途徑。NFB活化后可增強(qiáng)TNF和IL1的基因轉(zhuǎn)錄，使其產(chǎn)生和釋放增多，進(jìn)而再次激活NFB；NFB活化后還可使IL6和IL8產(chǎn)生和釋放增多，導(dǎo)致最初的炎癥信號(hào)進(jìn)一步放大。（2）經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外的負(fù)反饋途徑。在細(xì)胞內(nèi)，NFB活化后，在啟動(dòng)炎癥介質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，IB和p105的基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。這些抑制成分的增多有助于將NFB限制在細(xì)胞質(zhì)中，使活化的NFB活性下調(diào)，終止細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，并限制急性炎癥反應(yīng)。此外，NFB的活化，使p50同源二聚體生產(chǎn)增多，此種二聚體不能被IB有效結(jié)合，并缺乏轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，易

8、位至細(xì)胞核后，可與NFB競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合B序列，抑制NFB的活性。在細(xì)胞外，LPS、腫瘤壞死因子（TNF）和IL1能刺激反向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL10的產(chǎn)生，后者能阻斷單核細(xì)胞中內(nèi)毒素誘導(dǎo)的NFB的活化，抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，限制急性炎癥反應(yīng)。正負(fù)反饋兩種調(diào)節(jié)方式往往是同時(shí)進(jìn)行的，至于NFB的活化狀態(tài)則取決于何種調(diào)節(jié)占優(yōu)勢(shì)。2  NFB和CIRINFB廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，包括腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。許多研究證實(shí)CIRI后有NFB表達(dá)的增加。Shen等4應(yīng)用大鼠全腦缺血再灌注（GCIRI）模型，缺血30 min于612 h后發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)NFB活性較對(duì)照組增高

9、10倍。Stephenson等5發(fā)現(xiàn)在鼠大腦中動(dòng)脈閉塞2 h，再灌注后2 h、6 h和12 h腦缺血灶中NFB的活性進(jìn)行性的增加，在缺血區(qū)皮質(zhì)和紋狀體中有p50和p65的表達(dá)。Williams等6發(fā)現(xiàn)在再灌注后24 h缺血區(qū)大腦半球的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞以及浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中有很強(qiáng)的NFB表達(dá)。Numi A等7在人腦卒中死亡后23 h、28 h和38 h尸檢腦梗死灶中觀察到23 h神經(jīng)元胞漿中有很強(qiáng)的NFB活性表達(dá)，28 h在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均檢測(cè)到NFB的活性，38 h只有細(xì)胞核中有中等量的NFB表達(dá)，證實(shí)了人類腦卒中后12 d NFB被激活并轉(zhuǎn)移至神經(jīng)元細(xì)胞核中。NFB活性增高

10、后對(duì)腦具有保護(hù)作用還是損傷作用目前仍存在異議。Crack PJ8等認(rèn)為NFB對(duì)腦具有保護(hù)作用還是損傷作用，主要取決于NFB產(chǎn)生部位、刺激物（活化信號(hào)）、產(chǎn)生量和持續(xù)時(shí)間等。Clemens等9用四管堵塞法（4vessel occlusion）造成鼠前腦缺血30 min再灌注24 h后發(fā)現(xiàn)NFB在前腦神經(jīng)元中只有短時(shí)間的活性增高，而72 h在海馬CAI區(qū)凋亡的神經(jīng)元中仍有NFB活性表達(dá)，因此認(rèn)為再灌注24 h后NFB可能誘導(dǎo)神經(jīng)元中保護(hù)因子的產(chǎn)生，而再灌注72 h海馬區(qū)神經(jīng)元NFB活性持續(xù)表達(dá)可誘導(dǎo)CAI神經(jīng)元死亡蛋白的產(chǎn)生。Domanskajanik K等10在研究海馬不同區(qū)域神經(jīng)元時(shí)發(fā)現(xiàn)，缺血

11、3 h NFB活性增高，缺血34 d，海馬CAI區(qū)錐形細(xì)胞可見(jiàn)DNA斷裂片斷。Nurmi A等7發(fā)現(xiàn)在持續(xù)性局灶性腦缺血中NFB能促進(jìn)腦梗塞的形成。Stephenson11等用有神經(jīng)保護(hù)作用的抗氧化劑LY341122減低NFB的激活，使再灌注后DNA片段減少，梗死面積縮??；Wang YH等12發(fā)現(xiàn)黃衫素可通過(guò)其抗氧化作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)NFB的活化而減輕腦缺血再灌注損傷進(jìn)而間接證明了NFB有神經(jīng)損害作用。3  Bcl2、Bax與CIRICIRI中以神經(jīng)元為主的細(xì)胞凋亡是其重要的病理生理過(guò)程。Bcl2基因家族是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因，Bc12和Bax分別是Bc12家族中最具代表性的抑制凋亡

12、蛋白和促進(jìn)凋亡蛋白，二者的比值決定細(xì)胞的存活與凋亡。Bax可與Bcl2蛋白形成異源二聚體或自身形成同源二聚體。當(dāng)Bax蛋白受到凋亡刺激因素作用后，由胞質(zhì)向線粒體外膜轉(zhuǎn)位，與膜上電壓依賴性離子通道結(jié)合，使之激活，形成同源二聚體，并促使凋亡相關(guān)蛋白如細(xì)胞色素C、caspase酶原等從線粒體間隙釋放入胞質(zhì)中，執(zhí)行凋亡程序。但隨著B(niǎo)cl2蛋白表達(dá)量的上升，Bcl2可通過(guò)與Bax競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，使越來(lái)越多的Bax同源二聚體分開(kāi)，與Bc12形成比BaxBax更穩(wěn)定的BaxBc12異源二聚體，“中和”了BaxBax誘導(dǎo)凋亡的作用即封閉了Bax形成孔道的活性，阻止細(xì)胞色素C等穿過(guò)線粒體膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，避免凋亡啟動(dòng)復(fù)

13、合物的形成，從而抑制細(xì)胞凋亡13。通常，含少量Bax的細(xì)胞只需低水平的Bc12即可達(dá)到形成BaxBc12異源二聚體的嚴(yán)格化學(xué)劑量，從而終止凋亡的發(fā)生。因此，BaxBc12異源二聚體形成的調(diào)節(jié)是細(xì)胞凋亡調(diào)控中一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。然而，也有研究提示，Bcl2和Bax可獨(dú)立地調(diào)節(jié)凋亡。因?yàn)?，無(wú)Bax存在時(shí)，Bc12仍可抑制凋亡；無(wú)Bc12存在時(shí)，Bax也能夠促進(jìn)凋亡；而且，Bax缺乏與Bcl2表達(dá)可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)影響凋亡。余涓等14用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）2 h/再灌注24 h模型，用TTC染色觀察腦梗死面積，TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，免疫組化法檢測(cè)腦組織Bcl2和Bax蛋白表達(dá)

14、，結(jié)果損傷側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率與Bax蛋白表達(dá)均明顯升高，Bcl2/Bax比值明顯下降。王新高等15也用同樣的方法檢測(cè)到大鼠頸動(dòng)脈閉塞90 min/再灌注48 h模型梗死灶中Bcl2/Bax比值明顯下降，并設(shè)想通過(guò)上調(diào)Bcl2/Bax來(lái)實(shí)現(xiàn)保護(hù)線粒體，對(duì)抗細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對(duì)抗CIRI。Xia CF等16將人類組織激肽釋放酶基因于鼠MCAO后移入鼠腦組織，經(jīng)過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)在CIRI中激肽釋放酶可通過(guò)調(diào)節(jié)B2激肽受體，提高大腦NO及Bcl2的水平，降低過(guò)氧化物的產(chǎn)生和Bax的水平來(lái)抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管和神經(jīng)再生。Amemiya S17等在用依達(dá)拉奉（自由基清除藥）對(duì)抗CI

15、RI的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該藥是通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl2/Bax依賴的抗凋亡機(jī)制來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的。4  NFB與Bcl2、BaxBcl2基因家族包括Bclxshort、Bcl2、Bclxlong、Bad、Bak、Bax等，其中Bcl2、Bclxlong具有抑制凋亡的作用，Bclxshort、Bad、Bak、Bax則有促進(jìn)凋亡的作用。Dixion等18在研究中發(fā)現(xiàn)，Bclx基因5啟動(dòng)子區(qū)存在NFB結(jié)合一致性序列NFB/CS4，而B(niǎo)cl2家族其他成員在前5個(gè)調(diào)控區(qū)中也包含NFB/CS4一致性序列。海馬CA1區(qū)NFB于缺血72 h被持續(xù)激活，致使Bclx轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，因而B(niǎo)clxshort增多，后者將促

16、進(jìn)細(xì)胞的凋亡過(guò)程。Qiu J等19進(jìn)一步研究認(rèn)為，在全腦缺血后可形成cRel/p50和p50/p50兩種二聚體形式，兩者均可結(jié)合至海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞Bclx基因啟動(dòng)子的NFB/CS4序列上，而只有p50/p50可以與前腦底部神經(jīng)元細(xì)胞的Bclx基因啟動(dòng)子的NFB/CS4序列相結(jié)合。不同組合形式的NFB二聚體對(duì)缺血有不同的反應(yīng)，這是NFB在CIRI缺血缺氧過(guò)程中對(duì)Bclx基因表達(dá)的組織特異性調(diào)控的過(guò)程有所不同所致；同時(shí)，NFB對(duì)凋亡細(xì)胞所起的作用還與組織細(xì)胞的類型、特征、刺激持續(xù)時(shí)間、頻率及二聚體的活性度有關(guān)19，20。NFB的激活增加缺血神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，但其作用在不同類型細(xì)胞各不相同，小膠質(zhì)細(xì)

17、胞的NFB的激活促進(jìn)了缺血神經(jīng)元的變性，而神經(jīng)元的NFB的激活可增加其卒中后的存活率21。目前認(rèn)為NFB既為細(xì)胞生存因子即抗凋亡因子存在，也作為前凋亡因子存在。在TNF激活引起細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制中NFB的激活起了重要的抗凋亡作用。抑制NFB活性可明顯增加神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)TNF誘導(dǎo)凋亡的敏感性22，說(shuō)明NFB具有抗凋亡作用。這一結(jié)果也被Hill WD等23證實(shí)，他們觀察了NFB抑制劑DDTC對(duì)短暫MCAO后DNA斷裂和腦梗塞面積的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DDTC治療組DNA斷裂較對(duì)照組明顯增多，同時(shí)腦梗塞面積也增大，間接說(shuō)明NFB具有抗凋亡作用。NFB激活后引起的抗凋亡機(jī)制是由于上調(diào)了抗凋亡基因的表達(dá)，抗

18、凋亡基因包括TRAF1、TRAF2、cIAP1、cIAP2等，它們是NFB轉(zhuǎn)錄活性的靶基因與抵抗TNF介導(dǎo)的凋亡有關(guān)。Urnowey S等24在研究齦擬桿菌對(duì)成人口腔的感染及牙齦組織的破壞時(shí)，觀察到感染212 h，NFB激活，同時(shí)伴隨其誘導(dǎo)的細(xì)胞抗凋亡基因Bfl1、Boo、BclXL、Bcl2、Mcl1、Bclw及存活素（Survivin）的表達(dá)，此時(shí)NFB起抗凋亡因子的作用。當(dāng)感染2436 h，NFB的活性仍有強(qiáng)的表達(dá)，但上述抗凋亡基因表達(dá)減少，前凋亡基因Nip3、Hrk、Bak、Bik、Bok、Bax、Bad、Bim和Moap1被激活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，故此時(shí)NFB充當(dāng)前凋亡因子。百事通 5&

19、#160; 結(jié)語(yǔ)CIRI病理過(guò)程機(jī)制復(fù)雜，NFB只是其中的一個(gè)方面，雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究和理論探索并取得了顯著的進(jìn)步，但NFB在其中的作用機(jī)制和途徑還不是很清楚，仍有待于進(jìn)一步研究和探索。參考文獻(xiàn)：1 Won SJ, Kim DY, Gwag BJ. Cellular and molecular pathways of ischemic neuronal death J. Biochem Mol Biol, 2002, 35(1): 6786.2 Lee JK, Burckart GJ. Nuclear factor kappa B: important transcriptio

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