pigletmodelSubchondralfractureafterischemicosteonecrosis

1、Subchondral fracture after ischemic osteonecrosisof the immature femoral head in piglet model 進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)研究以研究使用仔豬模型的未成熟股骨頭的缺血性骨壞死后軟骨下骨折的發(fā)展。 在將結(jié)扎緊緊地放置在股骨頸周圍以破壞股骨頭的血液供應(yīng)之后，研究了48只雄性仔豬。 在局部缺血誘導(dǎo)后2-8周對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂死。進(jìn)行射線照相，組織學(xué)和組織形態(tài)學(xué)評(píng)估。 在缺血性壞死的初始放射照相階段的32個(gè)梗死的股骨頭中的12個(gè)（38）中觀察到軟骨下骨折。 骨折主要見于那些血運(yùn)重建和修復(fù)開始的初始階段的股骨頭。組織形態(tài)計(jì)量評(píng)估顯示，

2、與對(duì)側(cè)正常頭相比，梗塞股骨頭的軟骨下區(qū)域的小梁厚度和體積減小。 在缺血性骨壞死后，軟骨下區(qū)域中的小梁骨更薄，并且由于缺乏新的骨形成而存在更少的骨體積。 這項(xiàng)研究的結(jié)果支持這一假設(shè)，未成熟股骨頭的軟骨下骨折發(fā)展為軟骨下區(qū)域中的小梁骨結(jié)構(gòu)改變的結(jié)果。 Introduction 新月形軟骨下射線可見線的出現(xiàn)是Legg-Calve-Perthes病1,2中最早的放射學(xué)標(biāo)志之一。 導(dǎo)致新月體征的軟骨下骨折的發(fā)展被認(rèn)為是從真性形態(tài)區(qū)分潛在perthes病形式的關(guān)鍵病理學(xué)事件3,4。 雖然已經(jīng)對(duì)在髖關(guān)節(jié)置換術(shù)時(shí)獲得的梗塞的成年股骨頭進(jìn)行了廣泛的研究5-9，但是由于缺乏病理標(biāo)本的可用性，對(duì)未成熟的股骨頭也不可

3、能進(jìn)行類似的研究。 結(jié)果，未成熟股骨頭缺血性壞死后這一重要事件的意義仍不清楚。Salter 3和Salter和Thompson 4提出，在Perthes病中，軟骨下骨折的發(fā)生是壞死骨再吸收的結(jié)果，并且在梗塞的骨性骨骺骨化后恢復(fù)扁織骨。 據(jù)信，修復(fù)過程通過產(chǎn)生編織骨而削弱軟骨下區(qū)域的承重能力，所述編織骨在受到與正常有力活動(dòng)相關(guān)的負(fù)荷時(shí)斷裂。 據(jù)我們所知，在文獻(xiàn)中只有一項(xiàng)研究提出了關(guān)于未成熟股骨頭中軟骨下骨折發(fā)展的所有科學(xué)數(shù)據(jù)。在缺血性壞死的仔豬模型中，Douglas和Rang 10在血管再生的部位觀察到軟骨下骨折。 他們沒有報(bào)告骨吸收或編織骨形成是否與骨折的發(fā)展相關(guān)。 除了這些數(shù)據(jù)，缺乏數(shù)據(jù)來支

4、持或反駁缺血性骨壞死后未成熟股骨頭中軟骨下骨折的所提出的機(jī)制。由于軟骨下骨折的發(fā)展可能是預(yù)示由于缺血性骨壞死而復(fù)雜的perthes病和其他髖部病變中的股骨頭畸形的發(fā)展的關(guān)鍵事件，因此定義有助于其發(fā)展的過程是重要的。 定義這些過程可能揭示潛在的治療策略，可以早期應(yīng)用以防止股骨頭畸形的發(fā)展。 因此，我們使用仔豬模型進(jìn)行詳細(xì)的射線照相和組織學(xué)研究，以調(diào)查未成熟股骨頭的缺血性骨壞死后軟骨下骨折的發(fā)展。Materials and methods 實(shí)驗(yàn)研究由機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。 使用4-6周齡（6-9kg）的雄性約克夏小豬。 如前所述11，通過手術(shù)將結(jié)扎線緊緊地放置在股骨頸周圍來誘發(fā)股骨頭骨骺的

5、缺血性骨壞死。 所有動(dòng)物用戊巴比妥過量安樂死。在誘導(dǎo)局部缺血后，在第2周處死10只動(dòng)物，在第3周處死3只動(dòng)物，在第4周處死12只動(dòng)物，在第6周處死3只動(dòng)物，并在第8周處死20只動(dòng)物。 切除近端股骨，并使用Faxitron Cabinet X射線系統(tǒng)（Hewlett-Packard，McMinville，Oregon，USA）作為整體進(jìn)行射線照相。 然后使用精密圓形金剛石鋸（Isomet 1000; Buehler，Lake Bluff，Illinois，USA）將股骨頭在冠狀面中切成3mm厚，并進(jìn)行射線照相以產(chǎn)生斷層圖像。 將對(duì)側(cè)作為對(duì)照。Histological procedure 將股骨頭

6、部分在真空下固定在10中性緩沖福爾馬林中。 組織學(xué)切片的產(chǎn)生和檢查，如前所述11,12。 將來自每個(gè)頭部的一半切片轉(zhuǎn)移到EDTA溶液中用于脫鈣和石蠟包埋。 將剩余的部分置于一系列用于甲基丙烯酸甲酯包埋的分級(jí)乙醇溶液中。 將石蠟塊切成5mm厚并用蘇木精和曙紅染色。 將塑料塊在雪犁切片機(jī)上切成4mm厚，并根據(jù)von Kossa和McNeals四色染色用5硝酸銀染色。Histomorphometry 用von Kossa和McNeal的四色染色染色的切片用于確定美國骨和礦物研究學(xué)會(huì)采用的小梁指數(shù)13。 使用來自每只動(dòng)物的股骨頭的中心區(qū)域的代表性切片。 為了根據(jù)平行板模型確定小梁骨體積，組織體積，小梁

7、分離，小梁厚度和小梁數(shù)， 使用Bioquant圖像分析系統(tǒng)（Bioquant Image Analysis Corporation，Nashville，Tennessee，USA）測(cè)量組織面積，骨面積和小梁周長。根據(jù)美國骨與礦物研究協(xié)會(huì)13批準(zhǔn)的指南計(jì)算得到的指數(shù)。 在距軟骨 - 骨連接處1mm的距離內(nèi)進(jìn)行測(cè)量，以在骨骺的軟骨下區(qū)域中包括初級(jí)和次級(jí)海綿。Statistical analysis 使用配對(duì)t檢驗(yàn)（雙側(cè)）分析來自梗塞和對(duì)側(cè)正常頭的小梁指數(shù)。 小于0.05的P值被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。 所有數(shù)據(jù)表示為平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差Results 所有48個(gè)股骨頭顯示缺血性骨壞死的射線照相證據(jù)。 在48

8、個(gè)梗塞的股骨頭中，32個(gè)股骨頭具有較小的骨性核，在射線照相評(píng)估中具有輕度或無股骨頭變平。 這些股骨頭被分類為處于缺血性骨壞死的初始階段，并且評(píng)估是否存在射線照相新月征（圖1）和軟骨下骨折的組織學(xué)證據(jù)（表1）。剩余的16個(gè)股骨頭具有中度至重度扁平的股骨頭與骨吸收和形成在骨骺內(nèi)的區(qū)域，在放射學(xué)評(píng)估時(shí)其具有碎片外觀。 這些股骨頭被分類為處于碎裂（吸收）階段。（a） 在缺血性壞死的誘導(dǎo)后4周，通過股骨頭骨骺中心的3毫米厚的截面。 梗死的股骨頭顯示在右邊，并且由于缺血性骨壞死和缺乏修復(fù)和血運(yùn)重建而具有淺色的骨質(zhì)骨。 注意，與左側(cè)所示的非梗死的頭相比，梗塞側(cè)上的骨骺軟骨變厚，骨化核較小，表明生長停止。 可

9、以看到骺軟骨與下面的軟骨下骨之間的分離。 （b）在（a）新月體征中所示骨骺的中央，三毫米厚的冠狀切片的放射照片在梗塞的股骨頭（右） 在初始階段的股骨頭在外科誘導(dǎo)缺血后4周內(nèi)（32只中的24只）主要在動(dòng)物中觀察到（表1）。 在局部缺血誘導(dǎo)后6-8周，主要在動(dòng)物中觀察到斷裂階段的股骨頭。在缺血性骨壞死的初始階段，32個(gè)股骨頭中有12個(gè)具有軟骨下骨折的組織學(xué)證據(jù)（表1）。 骨折被看作是骺軟骨肥厚區(qū)和軟骨下區(qū)的主要海綿之間的間隙或通過主要海綿體的小梁碎裂。 在軟骨下區(qū)域觀察到具有壞死碎片的小的碎片小梁，這表明這是由于機(jī)械負(fù)荷的結(jié)果。在該區(qū)域中沒有觀察到編織骨或新骨形成，并且在具有軟骨下骨折的所有梗塞頭

10、部中沒有成骨細(xì)胞排列在小梁內(nèi)。 在具有軟骨下骨折的組織學(xué)證據(jù)的12個(gè)頭部中的7個(gè)顯示出射線照相新月形標(biāo)志。 具有軟骨下骨折的組織學(xué)證據(jù)的大多數(shù)股骨頭來自仍然處于局部缺血誘導(dǎo)后8周的缺血性骨壞死的初始階段的那些股骨頭。 八個(gè)股骨頭中有七個(gè)在局部缺血誘導(dǎo)后8周出現(xiàn)軟骨下骨折后仍處于骨壞死的初始階段。在具有軟骨下骨折的12個(gè)股骨頭中，3個(gè)在骨骺中沒有顯示出血運(yùn)重建或修復(fù)的跡象。 這三個(gè)股骨頭來自在局部缺血誘導(dǎo)后2-4周安樂死的動(dòng)物。 七個(gè)股骨頭有纖維血管組織侵襲的骨骺。 即使在這些頭部中也沒有新的骨形成，并且修復(fù)組織僅存在于軟骨下骨折的周圍（圖2）。 剩余的兩個(gè)股骨頭顯示沿著骨折部位的整個(gè)長度存在纖

11、維血管組織。 沒有新骨或編織的骨形成。缺血損傷對(duì)股骨頭軟骨下區(qū)域的影響使用組織形態(tài)學(xué)測(cè)量，在缺血誘導(dǎo)后4周沒有軟骨下骨折的七個(gè)頭中定量評(píng)估（圖3）。 由于具有軟骨下骨折的頭部具有嚴(yán)重的小梁碎裂和解體，它們不能定量評(píng)估。 隨著由缺血性損傷引起的軟骨內(nèi)骨化的停止，由于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的死亡，在原發(fā)松質(zhì)骨上不存在新的骨形成和骨重建。與對(duì)側(cè)正常側(cè)相比，梗塞側(cè)的軟骨下區(qū)域的組織形態(tài)計(jì)量評(píng)估顯示平均小梁厚度和骨體積分?jǐn)?shù)顯著降低（兩者的P 0.01，表2）。 與對(duì)側(cè)正常側(cè)相比，梗塞側(cè)的平均小梁數(shù)增加（P = 0.05）。 在平均小梁分離中沒有觀察到顯著差異。（a） 局部缺血誘導(dǎo)8周后來自梗塞股骨頭的切片的

12、低倍放大顯微照片。 在骨性骨骺周圍（蘇木精和曙紅染色，5）觀察到由纖維血管組織侵入的存在所證實(shí)的血運(yùn)重建。 （b）骨折骨膜周邊的高倍放大顯微照片，其中在骨折部位附近看到纖維血管組織侵入（箭頭）（蘇木精和伊紅染色，40）Discussion 研究顯示一些未知的未成熟股骨頭的軟骨下骨折的發(fā)展的觀點(diǎn)。 雖然眾所周知，缺血性骨壞死損傷骨軟骨下生長板、軟骨周圍骨軟骨、軟骨內(nèi)骨化11,14,15，其對(duì)軟骨下區(qū)骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響尚未在未成熟的 股骨頭研究。我們的研究結(jié)果表明，梗死頭部中的軟骨內(nèi)骨化的停止導(dǎo)致存在于軟骨下區(qū)域中的未成熟小梁（原發(fā)性骨質(zhì)疏松）的量與正常對(duì)側(cè)股骨頭相比減少。 此外，梗塞的頭部中的未成熟

13、小梁保持較薄，因?yàn)闆]有新的骨形成和重塑。 由于細(xì)胞死亡，通常包圍鈣化軟骨和未成熟小梁以產(chǎn)生新骨和增加小梁厚度的成骨細(xì)胞不存在?？赡艿氖?，結(jié)構(gòu)變化降低了梗塞股骨頭中的軟骨下區(qū)域的機(jī)械性質(zhì)。 此外，必須記住，盡管在疾病過程的早期階段在梗塞側(cè)沒有新的骨形成和生長，但是在對(duì)側(cè)正常側(cè)上持續(xù)的骨形成和生長，這有助于骨小梁結(jié)構(gòu)之間更大的差異 雙方。 這些小梁差異以及生長中的機(jī)械負(fù)荷很可能有助于軟骨下骨折的發(fā)展。（a）來自非梗死股骨頭的軟骨下區(qū)域的顯微照片。 鈣化的軟骨（藍(lán)色）被新骨（粉紅色）和成骨細(xì)胞（箭頭）包圍，產(chǎn)生原發(fā)性骨質(zhì)疏松和末成熟小梁的增厚。 （b）局部缺血誘導(dǎo)4周后來自對(duì)側(cè)，梗塞股骨頭的軟骨下區(qū)

14、域的顯微照片。 沒有成骨細(xì)胞排列鈣化軟骨和原發(fā)松質(zhì)骨附近，沒有新骨形成（箭頭）。 注意，與（a）中所示的對(duì)側(cè)非梗死側(cè)相比，存在的原發(fā)松質(zhì)骨量和更薄的小梁的量減少。 顯微照片在相同的放大倍數(shù)（蘇木精和伊紅染色，100）下獲得。本研究的組織形態(tài)學(xué)結(jié)果支持了早期使用仔豬模型進(jìn)行機(jī)械研究的結(jié)果16,17。 在缺血誘導(dǎo)后2周，修復(fù)過程尚未開始的時(shí)間點(diǎn)，梗死的股骨頭的壓痕測(cè)試顯示與對(duì)側(cè)正常股骨頭相比，壓縮剛度降低5217。 類似地，梗塞股骨頭的骨芯的機(jī)械測(cè)試分別顯示出與缺血后誘導(dǎo)2周時(shí)對(duì)側(cè)正常骨芯相比，骨模量和屈服應(yīng)力分別降低了59和4616?？傊?，這些研究支持這樣的假設(shè)：未成熟股骨頭中的軟骨下骨折由于在

15、軟骨下區(qū)域中受損的小梁骨的機(jī)械性失效而發(fā)展，而不是由于修復(fù)過程或新的編織骨形成 。 最近使用定量反向散射電子成像的骨礦物質(zhì)密度分布的研究提供了在疾病過程的早期和軟骨下骨折的發(fā)展中的機(jī)械強(qiáng)度丟失的進(jìn)一步解釋18。在該研究中，在軟骨下區(qū)域觀察到壞死性小梁的高度礦化。 在仔豬模型中誘導(dǎo)缺血后4周，發(fā)現(xiàn)梗塞股骨頭的軟骨下區(qū)域具有礦化的顯著增加（分別為平均和峰值礦化增加23和17）和增加的同質(zhì)性， 導(dǎo)致更脆的骨，將更容易受影響致微骨折。我們的研究表明，不是所有梗死的股骨頭發(fā)展軟骨下骨折。 在該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，軟骨下骨折似乎?yōu)先發(fā)生在那些具有延長的缺血性骨壞死的初始階段的股骨頭中。 八個(gè)梗死的股骨頭中的七個(gè)在

16、缺血誘導(dǎo)后8周仍處于初始階段時(shí)具有軟骨下骨折。 這些股骨頭中的血管重建和再吸收被延遲，因?yàn)檫@個(gè)模型中的大多數(shù)股骨頭此時(shí)進(jìn)入了碎裂階段。由于軟骨下區(qū)域被機(jī)械損傷，如果初始階段持續(xù)更長的持續(xù)時(shí)間，則軟骨下骨折的風(fēng)險(xiǎn)將更高，因?yàn)槿狈乃拦切迯?fù)正常機(jī)械負(fù)荷下發(fā)生的微裂縫的能力。 骨壞死的較長初始階段將導(dǎo)致這些微裂縫在該區(qū)域中更大的積累，這可能最終導(dǎo)致表現(xiàn)為軟骨下骨折的結(jié)構(gòu)性破壞。在這些梗死的頭部中，沒有血管重建和再吸收的延遲，股骨頭最可能通過再吸收區(qū)域變形，并且不會(huì)發(fā)展軟骨下骨折。 在這些情況下，股骨頭畸形的發(fā)展可能不在軟骨下骨折之前。我們的結(jié)果與以下假說相矛盾：軟骨下骨折發(fā)展是新的編織骨形成的結(jié)果，

17、其在修復(fù)階段機(jī)械地劣于天然層狀骨。 在我們的研究中，沒有發(fā)生軟骨下骨折的梗死性股骨頭在骨折區(qū)域具有新的骨形成。 軟骨下骨折發(fā)生在軟骨下區(qū)域的新骨形成開始之前。作為血管重建的結(jié)果而出現(xiàn)軟骨下骨折和在軟骨下區(qū)域中存在纖維血管組織的假設(shè)是有爭(zhēng)議的。 在那些在缺血誘導(dǎo)后2-4周發(fā)現(xiàn)具有軟骨下骨折的三個(gè)股骨頭中完全沒有血管重建。 在大部分具有在局部缺血誘導(dǎo)后8周的軟骨下骨折的股骨頭中，在骨折部位的外周末端僅觀察到少量的纖維血管組織侵入。 這是可能的血運(yùn)重建和早期骨吸收在骨折的周邊開始的。然而，從本研究中的組織形態(tài)學(xué)研究結(jié)果，沒有血運(yùn)重建的一些股骨頭發(fā)現(xiàn)軟骨下骨折，以及更早機(jī)械的研究16,17的梗死股骨頭支持這一假設(shè)血運(yùn)重建和吸收不起作用 在軟骨下骨折的發(fā)展中?？傊@項(xiàng)研究提供了一種新的見解缺血性壞死后未成熟股骨頭的軟骨