探討整合素β1在小鼠慢性心肌炎中的作用

1、探討整合素P1在小鼠慢性心肌炎中的作用摘要： 目的 觀察整合素P 1（CD29）在慢性心肌炎小鼠心肌的表達，探 討其在慢性心肌炎中的作用。方法 豬心肌肌凝蛋白致Balb/c小鼠自身免疫性心 肌炎模型，觀察并記錄免疫小鼠發(fā)病情況，同時用免疫組化SP法檢測CD29在心 肌的表達變化。結(jié)果 實驗早期（初次免疫后14、30 d），小鼠心肌淋巴細胞浸潤較明顯，CD29在心肌的表達高于正常組（P關(guān)鍵詞：整合素P 1;慢性心肌炎； 心肌肌球蛋白擴張型心肌?。―CM）是導致心力衰竭的常見病因，其病因和發(fā)病機制目前還不十 分清楚,且尚無有效治療手段。近年來自身免疫學機制在該病發(fā)病中的作用日益 受到重視1。整合素

2、P 1（CD29）是整合素家族中的一員，它在炎癥反應(yīng)、細胞 的增殖、分化，組織的修復、凋亡及基因表達的調(diào)節(jié)上起著重要作用。本研究通 過檢測CD29在慢性心肌炎小鼠心肌的表達情況，探討其在心肌炎及DCM發(fā)生及發(fā)展過程中的作用。1材料與方法動物 近交系Balb/c小鼠（武漢生物制品研究所，雌雄不限）,4周齡，16 20 g，按隨機原則分為實驗組和對照組。肌凝蛋白的制備及免疫 心肌肌凝蛋白用豬心室肌制備，主要參照文獻2。 將肌凝蛋白溶于mol/L磷酸鉀緩沖液中，終濃度mg/ml,然后與等體積完全弗氏 佐劑（Sigma公司）混合研磨成乳濁液，在實驗組小鼠雙側(cè)腹股溝、腋部皮下及足 墊皮下注射，每只小鼠注

3、射肌凝蛋白量為1 mg。對照組僅用等量的mol/L磷酸1、7、鉀緩沖液與等體積完全弗氏佐劑混合液在相同位置注射。免疫時間為第30天。分別在初次免疫后第14、30、60和120天處死小鼠前，稱取小鼠的體重 及心臟重量，并計算二者比值。病理檢查 心臟離體后，以10和醛固定，石蠟包埋后切片，部分做常規(guī) HE染色，顯微鏡下觀察，余下切片待做免疫組織化學檢測。免疫組化SP法 將石蠟切片脫蠟及抗原修復，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后， 加3 ml/L過氧化氫處理10 min;再以PBS沖洗后，依次滴加正常羊血清（室溫30 min），大鼠抗小鼠單克隆抗體（Biolegend 公司）（1 : 200）（37 C

4、孵育60 min,PBS 洗），生物素標記的兔抗大鼠IgG（中山公司）（1 : 40，37C孵育30 min, PBS洗）， 以二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色、蘇木素襯染，然后常規(guī)脫水、透明、封片，鏡檢觀 察結(jié)果，呈棕黃色者判為陽性。采用HP IAS 20XX型圖像分析軟件統(tǒng)計陽性率。統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗，采用軟件進行 統(tǒng)計分析。2結(jié)果兩組小鼠不同時間點心重/體重比較與對照小鼠心臟重量與體重比值 與對照組比較，初次免疫后14 d實驗組小鼠心 臟重量與體重比值無顯著變化（P）;而在免疫30 d后，實驗組小鼠心臟重量與體 重比值明顯增加（P），見表1。表114

5、30天，心肌炎性細胞浸潤明顯，心肌細 主要為淋巴細胞，心肌細胞結(jié)構(gòu)完好。第（圖組比較：1）Pv,下表同病理檢查結(jié)果初次免疫后第 胞間質(zhì)可見到局灶性的炎性細胞浸潤，60120天，炎癥細胞減少，纖維化開始出現(xiàn)。對照組中均未見到上述改變1）。CD29表達變化隨著病程進展，CD29在心肌的表達逐漸增多（圖2）;與對 照組相比，在初次免疫30 d以后，實驗組小鼠心肌CD29的表達顯著增加（PV）， 見表2。表2兩組小鼠CD29在心肌的表達比較心肌凝蛋白結(jié)構(gòu) 即是近年來提CD29的作用，抗體誘導的關(guān)節(jié)3討論本實驗中，來自于異體（豬）的肌凝蛋白與小鼠自身抗原 相似，它可激活自身反應(yīng)性T細胞而誘發(fā)小鼠自身免疫

6、性心肌炎， 出的分子模擬理論1。近年研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)用抗體阻止 則能夠阻止遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生，這包括移植物對宿主疾病、炎、半抗原誘導的結(jié)腸炎等36。本實驗中，慢性心肌炎小鼠心肌 CD29的表 達隨著心肌炎癥及纖維化的進展而逐漸升高，其機制可能在于：為炎癥細胞的募集和保留提供了一種黏附環(huán)境7;在以后的過程中作為層黏蛋白、纖維素 連接蛋白和玻連蛋白的受體參與對心肌細胞的固定8;像急性心肌炎中高度表達的細胞間黏附分子一樣9，調(diào)節(jié)釋放毒素的免疫效應(yīng)細胞黏附到表達 CD29 的心肌細胞。在整合素家族中，CD29還獨特表達于心肌10，它可作為心肌細胞與細胞 外基質(zhì)（ECM）相互作用的黏附受體，使細胞

7、得以附著 ECM形成整體，介導細胞察 覺環(huán)境變化并做出反應(yīng)或改變環(huán)境的能力。本實驗建立的是一種持續(xù)刺激模型， 至初次免疫后第120天，小鼠心臟增大，心肌纖維化明顯，與此同時，心肌細胞 所表達的CD29也不斷增加,這可解釋為心肌不斷地對環(huán)境變化作出的反應(yīng)。CD29 是心肌細胞表面信號協(xié)同受體，并能調(diào)節(jié)傳統(tǒng)受體的信號通路，包括生長因子受 體、耦聯(lián)G蛋白受體。在CD29激活的過程中，多種蛋白在病灶黏附帶聚集形成 一個由CD29調(diào)節(jié)的信號傳導復合物黏著斑激酶（FAK）,FAK是細胞活動的調(diào)節(jié)物，體內(nèi)FAK缺乏時細胞活動性降低，F(xiàn)AK表達增高時細胞活動性增強。FAK磷酸化活性改變隨CD29密度增加而增加

8、。Schaller : 11證實CD29與特定的ECM 結(jié)合后在病灶所產(chǎn)生的信號有助于細胞的生長、存活。Ding 12等通過對主動脈狹窄的動物實驗發(fā)現(xiàn)，在從細胞肥大到心衰的發(fā)展過程中細胞凋亡和細胞表面 CD29與 ECM橋接的瓦解有關(guān)。本實驗中，心肌細胞受外周環(huán)境的影響，CD29的表達代償性增高。初次免疫后120 d心肌出現(xiàn)的纖維化主要是間質(zhì)的纖維化，以 成纖維細胞的增殖和膠原纖維的異常堆積為主要特征。這與CD29的表達增高也有關(guān)。因此，CD29與 ECMS白結(jié)合刺激細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑，促進了成纖維細 胞的生長與增殖，導致心肌的纖維化，最終促成自身免疫性心肌炎向心肌病的轉(zhuǎn) 化。本研究提示，在慢

9、性心肌炎的發(fā)展過程中，CD29參與了炎癥反應(yīng)及心肌的纖維化，促進了心肌炎向心肌病的轉(zhuǎn)化?！緟⒖嘉墨I】infectious agentsJ.Clin Invest2 Murukami U,Uchida K, Hiratsua1 Wucher pfenning for the in duct ion of autoim mun ity by，20XX： 108(8) : 1097 lOtJ.Biochemistry , 1976;80(3):T,et myosin from pig heart ventriclep urificati on and en zymatic prop erties61

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