分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課考試資料整理

1、 分子考試資料整理1. 質(zhì)粒DNA的構(gòu)型與電泳速率的關(guān)系？答：DNA分子的遷移速率取決于由DNA分子的大小與構(gòu)型而形成的分子篩效應(yīng)。在相同的構(gòu)型下，DNA分子遷移速率與其相對(duì)分子量成反比。相同分子量但不同構(gòu)型的DNA分子遷移速率不同。當(dāng)瓊脂糖凝膠的濃度較低時(shí)，電泳速率為：超螺旋DNA>線性DNA開(kāi)環(huán)DNA。2. 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理以及三種溶液的作用？基本原理 質(zhì)粒的分離是利用質(zhì)粒DNA與染色體DNA在變性與復(fù)性中的差異來(lái)達(dá)到的目的。 當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，由于染色體DNA與質(zhì)粒DNA拓樸構(gòu)型不同,染色體DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒

2、DNA的氫鍵雖被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤(pán)繞仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入中和液后, 溶液pH調(diào)恢復(fù)至中性，在高鹽濃度的情況下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等形成沉淀；不同的是，質(zhì)粒DNA復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，保持可溶狀態(tài)而留在上清中。這樣，通過(guò)離心可沉淀大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)。除去沉淀后上清中的質(zhì)?？捎梅勇确鲁樘徇M(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。三種溶液的作用（ 溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS (新鮮的)；溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2

3、 M 醋酸。）溶液I: Tris-Cl:適當(dāng)pH值,葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解,懸 浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部, EDTA:抑制DNase的活性，和抑制微生物生長(zhǎng)(是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑)溶液II：NaOH：是最佳的溶解細(xì)胞的試劑。 這一步要記住兩點(diǎn)：第一，不能用舊的NaOH；第二，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)， 必須溫柔混合，不然基因組DNA也會(huì)斷裂。SDS: 是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-R-蛋白質(zhì)

4、的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。 溶液III：醋酸鉀: K+離子會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；高濃度的鹽，使得沉淀更完全（在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或KAC，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀）。2 M的醋酸:中和NaOH，創(chuàng)造質(zhì)粒復(fù)性的環(huán)境。3. 感受態(tài)細(xì)胞制備過(guò)程應(yīng)注意的問(wèn)題；細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度 最好從-70甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。 細(xì)胞生長(zhǎng)密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個(gè)左右為佳。即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期

5、的細(xì)菌，可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的OD600（0.4-0.5）控制。（應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同；受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度 一般地，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5%；對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低；重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10-100倍。整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行 ，所用器皿及試劑都要滅菌。用純的試劑，注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染 整

6、個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開(kāi)冰浴 CaCl2處理后細(xì)胞很脆，動(dòng)作要輕，慢。化合物及無(wú)機(jī)離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；4. 挖膠過(guò)程應(yīng)注意什么？保證切下的條帶沒(méi)有外源DNA的污染。切膠時(shí)盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積。切膠時(shí)盡量在長(zhǎng)波長(zhǎng)下進(jìn)行，減少紫外對(duì)DNA的損傷。為了減少膠的體積，可以用相對(duì)比較薄的膠來(lái)做，可采用薄而寬的梳子來(lái)跑膠。5. 如何滅活RNase？A. RNase 滅活劑 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過(guò)和RNA酶的活性基

7、團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。 異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái)，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類(lèi)物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。B.RNase滅活劑C.玻璃器皿200高溫烘烤2小時(shí)D

8、.塑料器皿焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液處理。6. 提取RNA和DNA時(shí)所用的飽和酚有什么不同？水飽和酚又叫水平衡酚。水飽和酚的PH小于7，一般是PH為5.0左右，通常與異硫氫酸胍一起使用，用于細(xì)胞RNA的提取，在酸性環(huán)境中，DNA在酚相，RNA在水相。兩者就分開(kāi)了。Tris飽和酚一般PH大于7.8，用于DNA的提取。其中，酚是強(qiáng)的蛋白變性劑，可以使細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)變性析出。 由于PH值大于7，在堿性環(huán)境中DNA處于水相，RNA處于有機(jī)相。從而分離上清，即可得到DNA。7. 如何減少蛋白誘導(dǎo)過(guò)程中包涵體的產(chǎn)生？降低誘導(dǎo)溫度，一般15-25降低誘導(dǎo)劑ITPG濃度使用中等強(qiáng)度或弱的啟動(dòng)子進(jìn)行融

9、合表達(dá)增加蛋白質(zhì)折疊的添加劑與伴侶分子和折疊酶共表達(dá)選擇突變的菌株優(yōu)化培養(yǎng)基條件7. 單酶切時(shí)，為提高連接效率應(yīng)采取什么措施？為什么？通常選擇對(duì)質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其末端的磷酸基，防止環(huán)化， 通過(guò)連接反應(yīng)后形成的缺口可在轉(zhuǎn)化細(xì)胞后得以修復(fù)。8. 連接反應(yīng)中，插入片段與載體的合適比例是多少？ 載體與目的基因摩爾數(shù)之比為1：3-5 如果插入片段較小，而載體較大，和載體的摩爾比例3-6:1連接效果好，如果載體和插入片段大小相近，摩爾比1：1較好；如果插入片段和載體的摩爾比例過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致多克隆的插入；如果插入片段和載體的摩爾比例過(guò)小，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性增多。 9. 篩選陽(yáng)性克隆的方法？ 菌落PCR

10、、酶切鑒定、Cracking gel、菌落原位雜交、測(cè)序10. 藍(lán)白斑篩選的原理是什么？如何出現(xiàn)大量藍(lán)斑，可能是什么原因？藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法：許多載體（PUC序列）都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）。受體菌含編碼-半乳糖苷酶C端aa序列。當(dāng)無(wú)外源基因插入時(shí)，載體表達(dá)的N端-半乳糖苷酶多肽與受體菌表達(dá)的C端-半乳糖苷酶多肽功能互補(bǔ)，具有-半乳糖苷酶活性。可以將生色底物X-gal分解成藍(lán)色物質(zhì)，從而在培養(yǎng)基中形成藍(lán)色菌落。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，

11、造成插入失活，而使表達(dá)的產(chǎn)物不具有-半乳糖苷酶活性，不能分解底物X-gal，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。原因：1）載體與目的基因連接做的不好，重組質(zhì)粒太少，大量的自連載體進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。2）酶切不完全，未被酶切的空載體進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。11. 已知一個(gè)基因的核酸序列，如何進(jìn)行蛋白表達(dá)？步驟？目的基因的獲?。禾崛NA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)核酸序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增目的基因克隆載體的選擇與構(gòu)建：提取質(zhì)粒DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建，即外源基因與表達(dá)載體的連接：雙酶切，電泳檢測(cè)，切膠回收目的片段，連接，獲得重組質(zhì)粒。重組DNA導(dǎo)入受體菌：轉(zhuǎn)化，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌 重組體的篩選

12、：用菌落PCR方法篩選陽(yáng)性克隆，并將陽(yáng)性菌落保存留種?？寺』虻谋磉_(dá)：先將菌種復(fù)蘇、擴(kuò)繁；用IPTG分別誘導(dǎo)陽(yáng)性克隆菌和空載體菌；取適量蛋白樣，處理好后，上樣、跑膠，染色、脫色、拍照。觀察重組蛋白的表達(dá)情況。a. 對(duì)于陽(yáng)性克隆菌，向5ml菌液中加入IPTG至終濃度0.6mM（30ul 0.1M IPTG），繼續(xù)震蕩培養(yǎng)；b. 對(duì)于空載體菌，向5ml菌液中加入30ul 0.1M IPTG （終濃度0.6mM IPTG）；12.質(zhì)粒的特點(diǎn)是什么？結(jié)構(gòu)：大多為共價(jià)、閉合環(huán)狀、超螺旋（circular covalently closed DNA,cccDNA)功能：正常生長(zhǎng)非必須的，但賦予細(xì)菌某些性狀

13、特征（具有遺傳標(biāo)記）復(fù)制和遺傳：細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子，其復(fù)制獨(dú)立于細(xì)菌染色體,但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴(lài)于宿主編碼的蛋白和酶?？梢赞D(zhuǎn)移。13. PCR的原理是什么？PCR程序通常有哪幾個(gè)步驟？聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction，PCR）是模擬體內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程，在體外特異性擴(kuò)增DNA片段的方法，從而獲得大量的同一序列DNA。 每經(jīng)過(guò)一輪擴(kuò)增，模板分子數(shù)增加一倍，經(jīng)過(guò)n次循環(huán)后，模板分子數(shù)變?yōu)樵瓉?lái)的2n倍。步驟：PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之

14、成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。14. 當(dāng)兩種限制酶反應(yīng)條件不同時(shí)，若要用雙酶切，應(yīng)采取什么措施？ 答：要避免星活性及部

15、分酶切。（1）先用低鹽緩沖液中活性最高的酶切，再補(bǔ)鹽和第二種酶；（2）用一種酶消化后，以酚：氯仿：異戊醇抽提，再經(jīng)乙醇沉淀，將DNA重新溶解與適合第二種酶的緩沖液，加第二種酶消化；（3）先低溫酶，后高溫酶；（4）使用通用緩沖液。15. 大腸桿菌轉(zhuǎn)化（CaCl2法）的原理？ 0下，細(xì)菌處于CaCl2的低滲溶液中，菌體細(xì)胞膨脹成球形，DNA與CaCl2形成羥基-鈣磷酸復(fù)合物，粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子基因得以表達(dá)，在抗生素選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。16. 感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)

16、化中的影響因素？細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度 最好從-70甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。 細(xì)胞生長(zhǎng)密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個(gè)左右為佳。即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)菌，可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的OD600（0.4-0.5）控制。（應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同；受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度 一般地，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5%；對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低；重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效

17、率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10-100倍。整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行 ，所用器皿及試劑都要滅菌。用純的試劑，注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染 整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開(kāi)冰浴 CaCl2處理后細(xì)胞很脆，動(dòng)作要輕，慢。化合物及無(wú)機(jī)離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；17. CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNA時(shí)，低溫的主要目的是什么？熱休克溫度和目的是什么？低溫目的：（1）抑制細(xì)胞的旺盛生理代謝；（2）有助于DNACa2+吸

18、附于細(xì)胞表面（3）防止DNAase降解DNA 。 熱休克溫度是42；目的是使細(xì)胞攝入吸附于其表面的DNA。18. 影響PCR擴(kuò)增的因素有那些？ 引物的質(zhì)量與特異性；PCR循環(huán)條件（退火溫度）；Mg2+濃度；模板DNA的質(zhì)量；酶的質(zhì)量。 19. 引物設(shè)計(jì)的基本原則？引物長(zhǎng)度一般在1825堿基之間。避免引物內(nèi)和引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)兩個(gè)引物的Tm值要接近。 G+C含量在40%60%之間，避開(kāi)局部富含GC或AT，3端避開(kāi)AT rich結(jié)構(gòu) 堿基要隨機(jī)分布。 引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)，特別是3末端的3個(gè)堿基。引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。引物5端可以修飾，引物3端不可修飾。20. SD

19、S-PAGE的原理？SDS是一種陰離子表面活性劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵， 使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械臉?gòu)象。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合。PAGE聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱(chēng)Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱(chēng)Bi )在加速劑N N N N-四甲基乙二胺(簡(jiǎn)稱(chēng)TEMED)和催化劑過(guò)硫酸銨 (簡(jiǎn)稱(chēng)AP)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。21. SDS-PAGE電泳的速率為什么只與蛋白的分子量有關(guān)，而與所帶電荷多少無(wú)關(guān)？蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，所帶的SDS的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)本身的電荷量，因而就掩蔽或消除了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)分子間的電荷差異

20、對(duì)電泳遷移率的影響。電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量。22.提取RNA過(guò)程中，怎樣才能有效地降低材料本身給RNA提取帶來(lái)的降解？ 新鮮細(xì)胞：如果試劑沒(méi)有問(wèn)題，且外源性污染也可以排除，那么降解幾乎都來(lái)自裂解液的用量不足。如果將裂解液直接加入培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞，一定要使裂解液能覆蓋住細(xì)胞。 新鮮組織：某些富含內(nèi)源核酸酶的樣品(如肝臟，胸腺等)，即使使用電動(dòng)勻漿器勻漿也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮條件下將組織研碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。 冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后移至-70冰箱保存。樣品決不能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于-70冰箱中。冷凍樣品，即使是冷凍細(xì)胞，如果

21、不在液氮條件下研磨碎，而直接加入裂解液中勻漿，RNA也比新鮮樣品更容易降解。樣品在與裂解液充分接觸前決不能出現(xiàn)融化，所以研磨用具必須預(yù)冷，在碾磨過(guò)程中要及時(shí)補(bǔ)充液氮。樣品研碎后，在液氮?jiǎng)倓倱]發(fā)完時(shí)，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。 外源RNA酶的污染：試劑，器械及實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的RNA酶進(jìn)入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。內(nèi)源RNA酶的污染：抑制劑失效或者用量不夠，實(shí)驗(yàn)樣品過(guò)多；勻漿時(shí)溫度過(guò)高 23.異硫氰酸胍法提取RNA的原理？ 異硫氰酸胍可以裂解細(xì)胞釋放出核酸，并同時(shí)使蛋白質(zhì)變性，抑制內(nèi)源的RNase活性。在酸性條件下（NaAc pH4.0），RNA溶于水相，而DNA溶于有機(jī)相。這樣，在加入苯酚/氯

22、仿后，RNA就溶于上層水相中，而DNA溶于下層苯酚/氯仿中，蛋白處于中間層。含有RNA的水相被轉(zhuǎn)移出來(lái)以后，在異丙醇的作用下沉淀，從而被分離出來(lái)。24. 理想狀態(tài)下DNA、RNA OD260/280分別為多少？在什么范圍比較合適？偏大或偏小分別說(shuō)明什么？基因組DNA 1.7<OD260/OD280<1.9，質(zhì)粒DNA OD260/280: 1.8-2.0；DNA: 1.8 (RNA: 2.0)，比值<1.8：蛋白質(zhì)污染；比值>2.0: RNA污染理想的RNA2.0, OD260/280在1.9-2.1之間。比值如果過(guò)低，可能有蛋白質(zhì)污染，過(guò)高RNA可能已發(fā)生降解。 如果

23、OD260/OD280過(guò)低（<1.7），通?？梢酝ㄟ^(guò)減少組織和細(xì)胞的用量來(lái)實(shí)現(xiàn)。OD260/OD280比值偏低？ 蛋白質(zhì)污染：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，則用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚殘留：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。多糖或多酚的殘留：一些特殊的組織和植物中，多糖、多酚含量較多，這些殘留也會(huì)導(dǎo)致OD260/OD280比值偏低。因此，從這類(lèi)材料中提取RNA時(shí)，需要注意多糖、多酚

24、雜質(zhì)的去除。設(shè)備限制：測(cè)定OD260及OD280數(shù)值時(shí)，要使OD260讀數(shù)在0.1-0.5之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測(cè)OD值時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用10mM Tris，pH7.5或TE 。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值偏低。25. 基因組DNA提取的一般原理？如何判斷基因組DNA的濃度和質(zhì)量？將分散好的真核生物組織細(xì)胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚：異戊醇抽提的方法去除蛋白質(zhì)，得到的DNA經(jīng)乙醇沉淀或透析等方法進(jìn)一步純化。 紫外分光光度法 OD280；瓊脂糖凝膠電泳基因組DNA的質(zhì)量檢驗(yàn)：紫外分光光度法 OD260/280; OD260/230；酶切法（Hind II

25、I ）、完整性檢測(cè)：基因組DNA電泳，在電場(chǎng)中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象。26. 提取基因組DNA的用途有哪些？構(gòu)建基因組文庫(kù)、Southern 雜交、RFLP、基因克?。≒CR）、制作基因芯片27.提取基因組DNA所用試劑：組織消化液(100ml)： 5ml 1M Tris-HCl、4ml 0.5M EDTA、 2ml 10% SDS、 150ul 60mg/ml Protease K； Tris飽和酚； 酚/氯仿（1:1）； 氯仿； 無(wú)水乙醇； 70%乙醇；5M NaCl； TE28.RNase的來(lái)源？ 樣品、試劑、多次使用的器皿、手、說(shuō)話產(chǎn)生的唾沫、空氣29.RNase

26、酶注意事項(xiàng)玻璃器皿處理：量筒、試劑瓶等玻璃器皿須200烘烤2小時(shí)以上。塑料器皿處理：0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液處理，再用蒸餾水沖凈。試劑處理：實(shí)驗(yàn)用的所用試劑也可用DEPC處理，加入DEPC至終濃度0.1%，然后劇烈震蕩混勻10分鐘，然后高壓滅菌以消除殘余的DEPC。專(zhuān)用的RNA操作室、專(zhuān)用器械。操作時(shí)戴口罩、帽子、手套 一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，基本達(dá)到要求。注意：DEPC與氨水混合后會(huì)產(chǎn)生致癌物，須小心在通風(fēng)柜中使用。30. 組織和細(xì)胞樣品收集，保存？組織樣品收集后，需要立即保存在液氮中(1min)，或在樣品中加入一定量的保護(hù)劑，有一些商業(yè)

27、化的產(chǎn)品可以選用（RNA later， RNA store）。一般實(shí)驗(yàn)收集50-100mg組織就足夠了。31.RNA保存(-80)：DEPC-H2O 、0.1 mM EDTA、TE (10mM Tris, 1mM EDTA)32.如何估計(jì)RNA的產(chǎn)量？RNA的含量與組織和細(xì)胞的類(lèi)型有比較大的關(guān)系, 同時(shí)與抽提的方式有關(guān)mRNA的含量一般占總RNA含量的2-5%樣品如果低于20mg或10000個(gè)細(xì)胞，在抽提時(shí)需要考慮加入合適的RNA沉淀載體。電泳，加RNA marker來(lái)定量紫外分光光度計(jì)（OD260），通常0.5-1.5ug/ul比較合適33. 常用的RNA提取方法？異硫氰酸胍法、鹽酸胍法、R

28、NAzol法；Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。34. Solution D的成分及其作用？4M 異硫氰酸胍 （裂解細(xì)胞，抑制RNase） 25mM 檸檬酸鈉， pH7.0 (緩沖液)0.5% 十二烷基肌酸鈉 （裂解細(xì)胞，抑制RNase） DEPC水配制35. Trizol法提取昆蟲(chóng)中腸總RNA需要的試劑：氯仿：異戊醇（24:1）、異丙醇、75%乙醇（in DEPC-treated water ）、RNase free 水或0.5% 

29、SDS 溶液準(zhǔn)備不含 RNase的水，將其裝入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。靜置過(guò)夜，然后高壓滅菌。0.5% SDS溶液必須用DEPC預(yù)處理、高壓滅菌的水。36. 昆蟲(chóng)中腸總RNA的提取組織勻漿、相分離、沉淀RNA、洗滌RNA、沉淀再溶解、RNA檢測(cè)37. RNA提取注意事項(xiàng)在提取液中加入巰基乙醇對(duì)降低酚類(lèi)的干擾可能有所幫助 在沉淀核酸時(shí)可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強(qiáng)于異丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時(shí)，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤

30、其用異丙醇在室溫下沉淀對(duì)擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。溶于TE的核酸儲(chǔ)藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時(shí)要求以高濃度保存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解 。在抽提過(guò)程中，若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多，可以增加抽提次數(shù)。提取RNA請(qǐng)盡量在低溫下操作。 38. 如何提高RNA提取效率？充分勻漿，以分散細(xì)胞；選擇合適的提取方法；選擇新鮮的組織；選擇合適的樣品儲(chǔ)存條件；避免內(nèi)源和外源Rnase的污染；正確的沉淀方法：乙醇沉淀：0.1 倍體積的5 M NH4Ac + 2-2.5 倍體積的 無(wú)水乙醇， -20 >25 min ；異丙醇沉淀：0.6-1倍體積的異丙醇。39. mR

31、NA的分離純化：采用Oligo dT-纖維素，從總RNA中分離出mRNA。該法利用mRNA 3末端有Poly（A）的特點(diǎn)，在總RNA流經(jīng)寡聚（dT）-纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下， mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度洗脫時(shí)，mRNA被洗脫下來(lái)。一般而言，經(jīng)過(guò)二次Oligo dT柱后，可得到較高純度的mRNA。40. 核酸的貯存DNA保存：1）短期貯存： 4或-20存放于TE（Tris和EDTA）緩沖液中。TE緩沖液(PH為8)，可減少DNA脫氨反應(yīng)；EDTA可以抑制DNase的活性。2）長(zhǎng)期貯存：TE緩沖液中-70保存數(shù)年；41.提取基因組DNA主要試劑的作用： EDTA： 二

32、價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶；降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性SDS的作用：溶解膜蛋白和脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂；溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；對(duì)RNA、DNA酶有抑制作用；與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性蛋白酶K：水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)；蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可同時(shí)使用。苯酚的特點(diǎn)：蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑、抑制DNA酶活性；苯酚溶于有機(jī)溶劑，微溶于水；提取DNA前苯酚用Tris-Hcl飽和，防止吸收過(guò)多DNA，降低DNA的損失率；氧化苯酚會(huì)破壞DNA。42. 為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？ 苯酚在空

33、氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA分離，會(huì)使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。 氧化苯酚需要經(jīng)過(guò)高溫重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。PH8.0的Tris溶液可以使的抽提出的DNA進(jìn)入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實(shí)驗(yàn)中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。無(wú)水乙醇沉淀：沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負(fù)電荷，有助于分子之間的聚集。無(wú)水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出。43. 一個(gè)合格表達(dá)載體的組成要素：復(fù)制起始位點(diǎn)Ori 。即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA分子中只

34、有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)?？股乜剐曰颉？梢员阌诩右詸z測(cè)，如Amp+ ,Kan+多克隆位點(diǎn)MCS 克隆攜帶外源基因片段P/E 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子Terms 終止信號(hào)加poly（A）信號(hào) 可以起到穩(wěn)定mRNA作用44. 原核表達(dá)系統(tǒng)中的各因素：復(fù)制子 ：通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達(dá)量是非線性的正相關(guān) 篩選標(biāo)記和報(bào)告基因 ：氨芐青霉素 ，卡那霉素 啟動(dòng)子 ：?jiǎn)?dòng)子的強(qiáng)弱是對(duì)表達(dá)量有決定性影響的因素之一 組成型表達(dá) :組成型啟動(dòng)子 誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá) :IPTG融合表達(dá) ：GST, His-tag分泌表達(dá) :信號(hào)肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜 可溶性表達(dá) :轉(zhuǎn)錄終止子 :控制轉(zhuǎn)錄的RNA長(zhǎng)度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達(dá)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降 核糖體結(jié)合位點(diǎn) :多數(shù)載體啟動(dòng)子下游都有SD序列 表達(dá)菌株 :不同的表達(dá)載體對(duì)應(yīng)有不同的表達(dá)菌株 45. 對(duì)原核表達(dá)載體