細胞穿膜肽的研究進展

1、細胞穿膜肽的研究進展摘 要：細胞穿膜肽(CPP)是具有穿透多種細胞膜功能的小分子多肽,能攜帶生物活性大分子物質進入細胞。由于CPP 缺乏組織選擇性和靶向性,限制了其在腫瘤治療領域的應用。近年來發(fā)現(xiàn)的一些具有細胞穿透功能的短肽（少于30個氨基酸）即細胞穿膜肽（CPPs）,能夠有效地將蛋白質、多肽、核酸片段等以多種方式導入多種哺乳動物細胞,其轉導效率高且不會造成細胞損傷。CPPs的發(fā)現(xiàn)為生物大分子在細胞生物學、基因治療、藥物體內轉運、臨床藥效評價以及細胞免疫學等研究領域等均具有良好的應用前景。本文就CPPs的種類特點、內化機制、應用及其存在的問題進行討論和評述。關鍵詞：細胞穿膜肽；靶向性；穿膜機制

2、1 細胞穿膜肽的性質、分類 到目前為止,已發(fā)現(xiàn)了多種 CPPs, 它們共有的性質: 具有凈正電荷性和兩親性；穿膜轉運效率高; 可以導入近乎所有的細胞；可以攜帶多種活性物質進入細胞；可以通過固相合成或原核表達制備,方法成熟簡便。 CPPs 的分類以及統(tǒng)一的術語還沒有。根據不同的分類標準, 得到不同的種類。 最近有學者根據短肽的特點和來源將其分為3大類:蛋白衍生肽(protein derived CPPs), 如penetratin、TAT和pVEC等； 模型肽(model peptides) 如MAP和(Arg)7等；設計肽(designed CPPs)如MPG和Transportan等。從其兩

3、親性性質也可將其分為3類: 兩親性CPPs (PaCPPs), 如MPG、 transportan、TP10、Pep-1;中等兩親性CPPs (SaCPPs),如penetratin, RL16；非兩親性 CPPs (NaCPPs),如 R9。2 細胞穿膜肽的穿膜機制盡管細胞穿膜肽已經成為近年來的研究熱點，但其穿膜機制目前仍暫無定論，且存在很大爭論因此，弄清細胞穿膜肽的內化機制，是將其作為藥物載體應用于臨床研究前需要解決的首要問題目前，對于CPPs 穿膜機制的描述主要有以下2 種。第一，通過胞吞作用進入細胞這方面研究多是通過熒光標記并使用胞吞作用抑制劑的方法，通過對比胞吞作用抑制劑使用與否對

4、CPPs 及其底物入胞作用的影響， 來評價CPPs的入胞機制。第二， 通過靜電作用與細胞膜相結合并誘導膜脂質雙分子層產生短暫的孔隙而直接滲透進入細胞由于目前所研究的細胞穿膜肽多以陽離子 CPPs 為主， 如 HIV Tat， 寡聚精氨酸等因此，有人提出，細胞穿膜肽的穿膜機制可能與其電荷特性有關，而人體組織細胞表面為負電荷特性，也為陽離子 CPPs 與之吸附及發(fā)生穿透作用提供了理論依據 Herce 等認為細胞穿膜肽的陽離子特性不僅使 CPPs有易于與細胞膜表面的結合， 還能夠誘導膜雙分子層的失穩(wěn)并產生短暫孔隙 Herce 等進一步通過實驗測定脂質雙分子層的電子流向證實了這種假設， 并認為精氨酸殘

5、基在陽離子CPPs誘導的穿膜作用中扮演重要角色。3 細胞穿膜肽的應用近年來，細胞穿膜肽作為分子載體應用于體內外入胞轉運的研究越來越多 與其他生物大分子轉運方法相比，細胞穿膜肽介導的入胞作用具有很多優(yōu)勢首先， 細胞穿膜肽能夠有效轉導具有不同分子量和天然性質的大分子進入細胞；其次， 細胞穿膜肽毒性相對較??；再次，細胞穿膜肽的非特異性穿膜作用使其應用更廣泛；最后，細胞穿膜肽不僅可以應用于注射給藥，還可以用于鼻黏膜給藥口服給藥細胞穿膜肽可以運輸多種物質到哺乳動物的的多種細胞中，包括:小分子核酸，多肽，蛋白，質粒DNA，寡聚核苷酸，脂質體及其他一些納米藥物載體等。 這些應用為疾病診斷和治療提供了一種新方

6、法，大大推進了分子生物學、藥學、 細胞生物學、疫苗學、甚至影像學的發(fā)展。近年CPPs的應用進展如下：3.1 蛋白質及多肽類藥物的運輸對許多疾病使用外源蛋白質或多肽類藥物是一個非常有價值的治療方法。Wu 等利用穿膜肽的蛋白轉導功能來介導信號肽-綠色熒光蛋白-穿膜肽 NT4-GFP-Ant 融合蛋白通過細胞膜和血腦屏障到達靶細胞。Tat(Tat4860)能將細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑的細胞毒素肽模擬物P21EAF1/CIP1運輸到細胞核內,且研究發(fā)現(xiàn)Tat4860P10 可以誘導細胞凋亡。Zhang 等1根據一種螺旋肽CAI的結構設計出了一種細胞穿膜肽NYAD-1,它比CAI具有更穩(wěn)定的螺旋結構,

7、研究發(fā)現(xiàn), NYAD-1能夠穿過細胞膜并與Gag聚蛋白共定位于質膜上,破壞病毒顆粒的自組裝。研究者2設計了一種含有穿膜肽、彈性蛋白類似多肽 ELP (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)和一種衍生于細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑P21 的結合多肽,這種多肽能夠使 SKOV-3 卵巢癌細胞和HeLa子宮癌細胞的生長速率減慢而抑制它們的增殖。HIV-Tat 與小泰勒蟲抗原 Tp2 結合形成重組Tat-Tp2 融合蛋白,發(fā)現(xiàn)其能夠加強遲鈍的 CD8+T細胞反應的興奮性。3.2 核酸類藥物的運輸核酸類藥物的細胞運輸具有挑戰(zhàn)性。最近有關使用CPPs 進行核酸細胞運輸的例子較多。研究證明, 細胞膜穿透性寡

8、肽八聚精氨酸(R8)修飾的脂質體可以有效輸送 siRNA 進入細胞并增強其生物學功能。Palm-Apergi等3研究一種細胞穿膜肽 MAP,用這種典型的抗菌肽處理細菌產生細菌空殼,這種空可以載入所需的 DNA 或質粒并將其運輸進入哺乳動物細胞內,還可以用于預防接種。Meade 等4研究認為, CPPs 為雙鏈 siRNA 進行細胞內化去誘導 RNAi 反應提供了一種好方法。Veldhoen 等34研究發(fā)現(xiàn)一種新的載體肽 MPG能同時與核酸形成非共價連接的、具有高靈活性的復合物,它可以作為運輸 siRNA 的載體。與轉座子結合的“睡美人”轉座酶能將特殊基因轉移進目標動物體內。 這些特殊基因有助于

9、治療多種疾病。有研究5發(fā)現(xiàn)細胞穿膜肽 M918 可以完成“睡美人”轉座酶和一個外源轉座子質粒 (帶有一種抗生素基因)在體外的細胞內共轉導運輸。具有空間位阻的帶電荷中性寡核苷酸類似物, 如肽核酸 (PNA)和磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO),在反義引物的應用方面具有很好的生物學和藥理學性質。 然而,寡聚核酸在細胞內不能自由運輸,因此, Lebleu 等6研究了兩種富含精氨酸的 CPPs(R-Ahx-R)4AhxB (R =精氨酸, Ahx = 胺己苯酸酯, B =-丙氨酸)和 R6Pen,它們能夠在胞內體溶解劑存在的情況下, 在低摩爾濃度下將PNA和PMO進行有效的核運輸。研究發(fā)現(xiàn),固相合成穿膜

10、肽 Tat 能夠攜帶質粒 DNA 穿過細胞膜進行基因轉染,并對細胞活性無明顯影響7。3.3 小分子藥物運輸研究表明,富含精氨酸的細胞穿膜肽可以直接運輸磷酸二酰胺嗎啉齊聚物進入鼠類白細胞,抑制其基因表達和改變前體mRNA的剪接8。Lindgren 等43設計了一種 CPP 與細胞抑制劑甲氨蝶呤 (MTX) 的結合物, 用于克服乳腺癌腫瘤細胞對甲氨蝶呤的耐受。將 2', 5'-寡腺甙酸四聚物(2-5A)與短鏈 HIV-1Tat 肽用化學方法結合產生2-5A-Tat 嵌合體9,此嵌合體可以被細胞吸收并能在完整的細胞中活化核糖核酸酶L, 它可能為HIV的RNA 在體內的靶向破壞提供了一

11、種方法。3.3 增強藥物的吸收及其他特殊功能 Kamei 等10發(fā)現(xiàn)通過使用 CPPs 可以促進胰島素的腸內吸收。Khafagy 等11研究發(fā)現(xiàn) L-型穿膜肽 penetratin 可以顯著增加胰島素的滲透性而使其穿過鼻膜, 并對鼻吸收黏膜上的細胞完整性不會引起明顯的破壞。 Tunnemann 等12研究認為細胞穿膜肽介導的肽轉導作用不僅是一種對細胞內 Ca2+無副作用情況下可以增加心肌功能的唯一方法, 而且是一般細胞或干細胞中蛋白質之間相互作用的調節(jié)和控制的非常有用的工具。Kloss 等13研究發(fā)現(xiàn),含有410 個精氨酸殘基的寡聚精氨酸, 特別是 (Arg)8 能夠抑制細胞內主要的蛋白水解系

12、統(tǒng)。 當考慮寡聚精氨酸作為藥物的細胞內運輸載體時,必須考慮其對蛋白酶的制活性問題。有研究報道, 成功設計的一種新的穿膜肽Pep-1-K (衍生于穿膜肽Pep-1) 具有強的抗菌活性, 可以作為細菌選擇性抗菌肽14。Johansson 等50研究發(fā)現(xiàn)了一種含有 22 個氨基酸殘基的衍生于腫瘤抑制基因P14ARF的N端部分的肽ARF (1-22), 它是一種具有 P14ARF 功能的類似物,對細胞膜有穿透性, 膜破壞性低且能誘導細胞凋亡。以前研究認為大多數CPPs 可以易位穿過哺乳動物細胞質膜, 而不能穿過像酵母細胞的細胞膜。然而, Parenteau 等15對 20 種CPPs進行了測試, 發(fā)現(xiàn)

13、有一種肽Tp10能有效的穿過裂殖酵母細胞并在細胞內均勻分布。 由于治療分子不能穿過質膜, 基因和藥物運輸進入眼部組織,例如視網膜和角膜被阻礙, Johnson 等16研究發(fā)現(xiàn)了一種能用于眼部組織運輸的新肽 POD, 能夠運輸小分子和大分子藥物進入神經視網膜色素上皮細胞和角膜細胞等。如果能夠通過高分辨率成像技術追蹤干細胞的分布和分化的能力,對臨床和研究非常重要。Liu等17用一種典型的 CPP 承載釓顆粒,此顆?？梢杂糜诠撬栝g質干細胞的磁共振成像。 熒光成像技術確定此復合物可以內化進入干細胞質和核內, 毒性實驗和流式細胞儀分析表示此復合物不會影響細胞的生存和膜電勢梯度。關于 CPPs 的氨基酸序

14、列見表 1。 表1 CPPs 的氨基酸序列4 細胞穿膜肽在應用中的不足CPP 缺乏組織選擇性和腫瘤靶向性,單純憑借CPP 無法使抗腫瘤藥物定向積,使作用于腫瘤部位的藥物濃度減少,對正常組織的損傷性增大。同時 CPP 的正電性易與血漿中荷負電的成分發(fā)生相互作用,從而被網狀內皮系統(tǒng)快速清除, 導致 CPP在體內不穩(wěn)定,極大地限制了其在腫瘤治療中的應用18。因此,提高 CPP 的腫瘤靶向性是將其應用于腫瘤治療領域的關鍵。CPPs 在藥物運輸過程中的使用存在的另外一個弊端是其穩(wěn)定性差。CPPs 內化后, 由于體內含有各種蛋白酶, 它可能會酶解外源 CPPs 及其藥物分子；體內的環(huán)境包括 pH 值、離子

15、濃度等都有可能改變CPPs 的某些性質使其失去活性。因此, 必須通過尋找新的穩(wěn)定的 CPPs58或對現(xiàn)有的 CPPs 進行修飾改進來解決這方面的問題。 一些蛋白在內化進入細胞后不再具有生物活性,可以考慮在蛋白和 CPPs 之間插入一個連接分子來輔助在細胞內釋放有活性的蛋白和藥物。此外, CPPs 是否有免疫原性或半免疫原性及長期應用會對機體產生何種影響, 需要將 CPPs 序列進一步的優(yōu)化以提高其適用性19。一些證據顯示, CPPs可以與任意的分子結合,非靶向性進入細胞內, 導致生物活性藥物不必要的損失。因此,如果不能建立可行性使用方法以促進細胞特異性運輸,將限制細胞穿膜肽在機體內運輸藥物等方

16、面的應用。目前,在能夠有效利用 CPPs 運輸藥物以充分發(fā)揮治療作用方面有價值的應用實驗結果還鮮見報道。這種載藥方式在應用中是否存在潛在的細胞毒性以及運輸過程中缺乏細胞特異性等問題尚未引起足夠的的重視20。一些 CPPs 存在細胞內化差,出現(xiàn)細胞內代謝性降解及一些不良的生物效應如毒性和免疫原性等。需要進一步開展對 CPPs 的藥代動力學、體內分布等相關研究。5 展望 CPPs 的發(fā)現(xiàn)為生物大分子用于疾病治療帶來了曙光, 在細胞生物學、基因治療、藥物體內轉運、評價及細胞免疫學等研究領域均具有良好的應用前景。隨著研究深入，越來越多的 CPPs 及其類似物將被發(fā)現(xiàn)和構建，而作為研究基礎的對 CPPs

17、 的基本序列及穿膜機制的探討尤顯重要，特別是新的研究方法和研究手段的建立與驗證ACPPs 作為一種新型載體應用于靶向制劑，能夠顯著提高藥物的生物利用度，將逐漸成為 CPPs 領域的研究熱點筆者認為， 隨著研究的深入， 構建能夠被病變部位或細胞特異性識別并打開的連接鍵，或進一步提高 CPPs 融合多肽對靶組織微環(huán)境的敏感性。參考文獻：1 ZARO J L, SHEN W C. Quantitative comparison of membrane transduction and endocytosis of oligopeptidesJ. Biochem Biophy Res Comm, 20

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