總結(jié)-酵母酶活測定

1、 1 / 6 2. 9.3-Galactosidase酶活定量實驗 參考Clontech Yeast Protocols Handbook進行。 酵母酶活測定， 準備： 每個樣品，8 ml的YPD培養(yǎng)基，Y190菌株（轉(zhuǎn)化用）。 Z buffer，Z buffer+beta-巰基乙醇，Z buffer+ONPG，NA 2CO31)準備5 ml SD/-Leu /-Trp液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的酵母菌，同時將ONPG溶解在Z緩沖液中（4 mg/ml，調(diào)pH 7.0）并振蕩混勻1-2 hr； 2)旋渦振蕩器上將菌液劇烈振蕩 0.5-1min，立刻取出2ml加入8ml的YPDA中； 3)30250 rp

2、m搖3-5 hr，測OD 600在 0.5- 0.8之間并記錄確切OD值；4)取3個 1.5 ml的EP分別倒入 1.5 ml菌液，14,000 rpm離心30 sec，小心棄上清，加入 1.5 ml Z緩沖液，振蕩以重懸菌體； 5)離心去上清，加入300l Z緩沖液重懸菌體（則濃縮倍數(shù)為倍）；6)取 0.1 ml至新管中，液氮冷凍 2 / 6 0.5-1 min，37 0.5-1 min使其融化；7)反復凍融3次以上使細胞盡可能破碎； 8)取一個新管加入100l Z緩沖液作為空白對照； 9)每管中加入 0.7 ml Z緩沖液+-巰基乙醇，加入160l溶在Z緩沖液中的ONPG同時開始計時，將管

3、置于30溫?。?10)當溶液變?yōu)辄S色時，加入 0.4 ml Na 2CO 3中止反應(yīng)，計錄反應(yīng)時間t；11)14,000 rpm離心10 min，取上清，測OD 420值； 12)計算-Galactosidase酶活： -Galactosidase units=1,000×OD 420（t×V×OD 600） t為反應(yīng)時間（第10步記錄） V為 0.1×濃縮倍數(shù)（第5步記錄） OD 600為第3步所測OD值 2.9.4提取酵母蛋白 3 / 6 參考Clontech Yeast Protocols Handbook進行。 1)接酵母菌于SD/-Leu /-

4、Trp培養(yǎng)基中，30搖培過夜；2)擴培至50 ml YPDA培養(yǎng)基中，30搖培至OD 600為 0.4- 0.6，計算總OD 600值： 測得的OD 600值×培養(yǎng)液體積； 3)將菌倒入預冷的離心管中，41000×g5 min，棄上清，細胞重懸于50 ml預冷的超純水中； 4)41000×g5 min，棄上清，冷的超純水再洗一次，沉淀凍到液氮中，繼續(xù)下面的實驗或凍存于-80； 5)每 7.5OD 600加入100l60預熱的裂解緩沖液（用前加入PMSF和cocktail，因PMSF有半衰期，需每隔7 min補一次），60水浴小于2 min使菌體融化并重懸起來； 6

5、)轉(zhuǎn)移到 1.5ml的EP管中，加入適量glassbeads（80l/ 7.5OD 600），7010 min，劇烈振蕩1 min； 7)414,000 rpm離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中并置于冰上； 4 / 6 8)沉淀置于1003-5 min，劇烈振蕩1 min，414,000 rpm離心5 min，小心吸取上清，并將兩次的上清合到一起； 9)10010 min煮樣，即可進行western blot。 試劑配置 YPDA培養(yǎng)基：1 L配方：20 g Difo peptone，10 g Yeast extract，15 ml 0.2% adenine hemisulfate so

6、lution，加水至950 ml，滅菌后冷卻至55再加入50 ml 40%的葡萄糖（葡萄糖溶液可112滅菌或抽濾滅菌），若為固體培養(yǎng)基滅菌前還需加20 g/L Agar； SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基： 6.7g/LYeastnitrogenwithoutaminoacids， 0.67 g/L -Leu /-Trp DO supplement，若為固體培養(yǎng)基需加20g/L Agar，滅菌； SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基： 6.7 g/L Yeast nitrogen withoutamino acids， 0.6 g/L -Ade/-His /-Leu /-Trp D

7、O supplement，若為固體培養(yǎng)基需加20 g/L Agar，滅菌； 貯存液：10×TE： 0.1MTris-HCl，10mMEDTA，調(diào)pH 7.5滅菌， 10×LiAc：1 M LiAc，乙酸調(diào)pH 7.5滅菌， 50% PEG4000； PEG/LiAc：40% PEG，1×TE，1×LiAc； 5 / 6 Z緩沖液： 16.1 g/L Na 2HPO 4·7H 2O， 5.5 g/L NaH 2PO 4·H 2O， 0.75 g/L KCl， 0.246 g/L MgSO 4·7H 2O，調(diào)pH 7.0并滅菌；

8、Z緩沖液+-巰基乙醇：100 ml Z緩沖液加入 0.27 ml-巰基乙醇； 裂解緩沖液： 儲存液：8M尿素，5%SDS，40mMTris-HCl（pH 6.8）， 0.1 mM EDTA， 0.4 mg/ml溴酚蘭，使用前每毫升儲存液加入10l-巰基乙醇，并加蛋白酶抑制劑PMSF和cocktail。 6 / 6 2.10酵母互補實驗 所用的載體為Dr.Hiten D.Madhani實驗室（UniversityofCalifornia）惠贈的p415-ADH1改造，用ADH1啟動子驅(qū)動或?qū)DH1啟動子換為酵母BRE1啟動子，分別連接擬南芥的HUB1和HUB2基因，構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母bre1（YM1740），空載體轉(zhuǎn)化野生型YM1736（S288C）及bre1（YM1740）作為對照，統(tǒng)計細胞體積大小參照Hwang et al. （2003）進行，大體流程如下： 1)將酵母菌接于SD/-Leu培養(yǎng)基中，30搖培至OD 6000.6- 0.8；2)加入2%甲醛，3020 min固定； 3)離心收集菌體，用 0.1 M