TUNEL染色檢測細胞凋亡

1、7/ 6TUNEL法檢測細胞凋亡實驗原理和方法細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體 DNA首先 在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為 50-300kb的大片段。然后大約30%的染 色體DNA在Ca和Mg2依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切 斷，形成180200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn) 缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT） 的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素 形成的衍生物標記到DNA的3末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一 般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移

2、酶介導的缺口末端標記法（TUNEL。由于正常 的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA的斷裂，因而沒有3-OH形成，很少能夠被 染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（ni cktra nslation），使低分子量的DNA標記或染色，然后分析凋亡細胞。 TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態(tài)學相結合的研究方法，對完整 的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能準確的反應細胞凋亡最典型的 生物化學和形態(tài)特征,可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞 和從組織中分離的細胞凋亡測定,并可檢測出極少量的凋亡細胞,靈敏度遠比 一般的組織化學和生物化學測定法要高,因而在

3、細胞凋亡的研究中已被廣泛采 用。、過氧化物酶標記測定法脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛（digoxigenin） -11-dUTP在TdT酶的作用 可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈 DNA的3-0H末端，與dATP形成異多聚 并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結合。原理：下,體,在適合底物存在下,過氧化物酶可產(chǎn)生很強的顏色反應,特異準確的定位出正 在凋亡的細胞,因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地 高辛杭體結合的配體，因而非特異性反應很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎 動物甾體激素的交叉反應不到1%,若此抗體的Fc部分通

4、過蛋白酶水解的方法 除去后，則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的 或從組織中分離的細胞凋亡測定。（一）試劑配制1、磷酸緩沖液 PBS（ pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM， NaCI 200mM。2、蛋白酶 K (200 a g/m, pH7.4）：蛋白酶 K0.02g; PBS 100m。3、含 2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4)：H2O22.0ml; PBS緩沖液98.0mI。4、TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma 堿3. 63g 用0.1NHCI調節(jié) pH 至7.2，加 ddH20定容到1000ml;再加入二

5、甲砷酸鈉2996g 和氯化鈷0.238g。5、TdT酶反應液:TdT酶32 4 ； TdT酶緩沖液76譏混勻，置于冰上備用。6、洗滌與終止反應緩沖液：氯化鈉17. 4g;檸檬酸鈉8.82g; ddH20 1000ml7、0.05%二氨基聯(lián)苯（DAB）溶液:DAB 5mg; PBS 10m，l pH7.4,臨用前過濾后，加過氧化氫至0.02%。8、0.5%甲基綠（ pH4. 0):甲基綠0.5g;0.1M 乙酸鈉 100ml。9、100%丁醇, 100%、95%、90%、80%和 70%乙醇,二甲苯, 10%中 性甲醛溶液,乙酸,松香水等。0、 過氧化物酶標記的抗地高辛抗體（ ONCOR）二）實

6、驗步驟1、標本預處理：1）石蠟包埋的組織切片預處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95%和75%乙醇各洗一次，每次 3min。用PBS洗5min加入 蛋白酶K溶液（20ug/ ml）,于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗 4 次，每次2min,然后按下述步驟2進行操作。2）冰凍組織切片預處理：體。將冰凍組織切片置 10中性甲醛中，于室溫固定 10min 后，去除多余液 用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：次，乙酸（2: 1 ）的溶液中，于-20C處理5min,去除多余液體。用PBS洗兩 每次5min，然后按下述步驟2進行操作

7、。3）培養(yǎng)的或從組織分離的細胞的預處理：將約5X 107個/ml細胞于4%中性甲醛室溫中固定10min。在載玻片上滴加 50100 d細胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min,然后按下述步驟2進行操作。2、色缸中加入含2%過氧化氫的PBS于室溫反應5min。用PBS洗兩次, 每次 5min。3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加 2滴 TdT酶緩沖液，置室溫15min。4、用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加54gTdT酶反應液，置濕盒中于37C反應1hr （注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應液）。5、將切片置于染色缸中，加入已預熱到 37C的

8、洗滌與終止反應緩沖液, 于37C保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪 動。6、組織切片用PBS洗3次，每次5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化 物酶標記的抗地高辛抗體,于濕盒中室溫反應 30min。7、用PBS洗4次，每次5min。8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05 % DAB溶液，室溫顯色36min。9、0、起放下用蒸餾水洗4次，前3次每次1min,最后1次5min。于室溫用甲基綠進行復染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提 10次，最后1次靜置30s。依同樣方法再用100%正丁醇洗三次。11、用二甲苯脫水3次，每次2min,封片、干燥后，在光學顯微鏡下觀察 并記錄實驗結果。三）注意事項一定要設立陽性和陰性細胞對照。陽性對照的切片可使用 DNasel部分降解 的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松（1 gM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細胞 或人外周血淋巴細胞。陰性對照不加 TdT酶，其余步驟與實驗組相同。TUNEL assayTerminaldeoxynucleoti