多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase

1、l PCR技術(shù)1 導(dǎo)論多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）是美國(guó)Perkin-Elmer/Cetus公司人類遺傳研究室Mullis K. B.等人于1985年發(fā)明的一種快速體外DNA片段擴(kuò)增技術(shù)，是八十年代分子生物學(xué)資源領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性突破，被譽(yù)為分子生物學(xué)資源發(fā)展史上的又一里程碑。該技術(shù)一問世，就在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物工程、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等領(lǐng)域得到快速而廣泛的應(yīng)用，并且對(duì)已建立的基因克隆、DNA序列分析等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展也起了巨大的推動(dòng)作用。PCR技術(shù)是一種模擬自然DNA復(fù)制過(guò)程的體外酶促合成特異性核酸片段技術(shù)（亦稱無(wú)細(xì)胞分子克隆技術(shù)）。它

2、以待擴(kuò)增的兩條DNA鏈為模板，由一對(duì)人工合成的寡核苷酸作為介導(dǎo)，通過(guò)DNA聚合酶促反應(yīng)，在體外進(jìn)行特異DNA序列擴(kuò)增。其過(guò)程包括模板變性（denature）、引物退火（annealing）和用DNA聚合酶延伸（clongation）退火引物在內(nèi)的重復(fù)循環(huán)系列，使末端被引物5端限定的特異性片段成指數(shù)形式累積。由于在每一循環(huán)中合成的引物延伸產(chǎn)物可作為下一循環(huán)中的模板，因而每次循環(huán)中靶DNA的拷貝數(shù)幾乎呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。因此20次PCR循環(huán)將產(chǎn)生約一百萬(wàn)倍（220）的擴(kuò)增產(chǎn)物，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，并且具有從DNA粗制品和降解的DNA模板中擴(kuò)增靶序列的能力，這一點(diǎn)在生藥鑒定應(yīng)用

3、中尤為重要。PCR的原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，關(guān)鍵是運(yùn)用兩個(gè)起始引物，分別為待擴(kuò)增序列的相對(duì)的兩條單鏈DNA結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)分別位于待擴(kuò)增序列的兩端，并且3端相對(duì)，然后利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性，模仿體內(nèi)的復(fù)制，在兩個(gè)引物之間誘發(fā)聚合酶反應(yīng)。PCR反應(yīng)可以簡(jiǎn)述如下：在微量離心管中加入適量緩沖液，加微量模板DNA，四種脫氧單核苷酸（dNTP），耐熱Taq聚合酶及兩個(gè)合成DNA引物，并有Mg2+存在。1、加熱使模板DNA在高溫下（95左右）變性，雙鏈DNA解開而變成單鏈DNA游離于溶液中。這是所謂變性階段。2、PCR的引物是兩段人工合成的寡核苷酸鏈，長(zhǎng)度為1624個(gè)核苷酸殘基，其順

4、序由被擴(kuò)增的DNA片段兩端的序列決定。這兩段寡核苷酸鏈分別與模板DNA的正鏈和負(fù)鏈互補(bǔ)，所互補(bǔ)的位點(diǎn)一個(gè)在被擴(kuò)增序列的“上游”，一個(gè)在被擴(kuò)增序列的“下游”。高溫使模板DNA變性成單鏈以后，溫度降低，由于PCR反應(yīng)體系中引物的拷貝數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于模板DNA的拷貝數(shù)，因而引物與模板DNA形成復(fù)合物的機(jī)率要大大高于模板DNA兩條單鏈的重新結(jié)合。只要嚴(yán)格地控制復(fù)性的條件，復(fù)性過(guò)程是傾向于形成引物與模板的復(fù)合物的。這是退火階段。3、溶液反應(yīng)溫度升至中溫（72），在Taq酶作用下，以dNTP為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈。這是延伸階段。如此重復(fù)，改變反應(yīng)溫度，即高溫變

5、性，低溫退火，中溫延伸三個(gè)階段。這三次改變溫度為一個(gè)循環(huán)。每循環(huán)一次，使特異區(qū)段基因拷貝數(shù)擴(kuò)大一倍，一般30次循環(huán)，基因放大數(shù)可達(dá)2n倍。可用公式Y(jié)（1X）n表示，式中YDNA擴(kuò)增倍數(shù)，X擴(kuò)增效率，循環(huán)數(shù)為n。如X100%，n20時(shí)，Y1048576倍。但實(shí)際擴(kuò)增效率（X）不會(huì)達(dá)到100%。.2 試驗(yàn)條件本程序適用于自動(dòng)PCR操作，可適用于大多數(shù)情況，所用酶是不含核酸外切酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶，如Taq聚合酶等。【藥品試劑】引物（各50pmol）0.2mmol/L dNTPs（必須使用高質(zhì)量的dNTPs，這一點(diǎn)非常重要。dNTPs經(jīng)反復(fù)化凍后會(huì)發(fā)生降解，因此應(yīng)分成小份保存。應(yīng)注意混合物中四種dN

6、TP的量要相等）模板DNA：約0.051mg基因組DNA或0.0020.02mg質(zhì)粒DNATaq DNA聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut）10×PCR緩沖液（500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris·HCl，pH 8.3）礦物油電泳所需試劑【儀器設(shè)備】PCR擴(kuò)增儀電泳裝置微量離心機(jī)微量移液器（120ml和20200ml）0.5ml Eppendorf管紫外線觀察裝置及照相設(shè)備.3 操作程序1在無(wú)菌的Eppendorf管內(nèi)加入以下反應(yīng)物： 反應(yīng)物體積/ml 終反應(yīng)（1）10×緩

7、沖液2.51×緩沖液（2）4×dNTP2.5200 mmol/每種dNTP（3）引物C11.2525 pmol/每個(gè)反應(yīng)（4）引物C21.2525 pmol/每個(gè)反應(yīng)（5）模板DNA0.55 ng/每個(gè)反應(yīng)（6）無(wú)菌水16離心后混勻，95水浴反應(yīng)10 min，離心混勻。（7）Taq 聚合酶3U0.53U/每個(gè)反應(yīng)離心混勻。（8）石蠟油20ml293反應(yīng)2 min后開始以下循環(huán)：93變性反應(yīng)1 min；50退火反應(yīng)1 min；72延伸反應(yīng)3 min。經(jīng)過(guò)1735循環(huán)后，最后一個(gè)循環(huán)72增加5 min。循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于40保存。3取15ml反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染

8、色檢測(cè)擴(kuò)增的情況。2.2.2.4 應(yīng)注意的問題及其解決方法1PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化要優(yōu)化特定的PCR反應(yīng)，有必要試用不同的反應(yīng)組分和循環(huán)參數(shù)。表2-1列出了添加或改變某一試劑濃度對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響，從中大家可以得到一些線索以改進(jìn)反應(yīng)條件，提高PCR產(chǎn)量和/或特異性，一般情況下，只須改變一兩個(gè)參數(shù)就行了，如pH值和MgCl2濃度。表2-2給出了循環(huán)參數(shù)對(duì)PCR結(jié)果的影響。表2-1 PCR各反應(yīng)組分濃度對(duì)產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量的影響反應(yīng)組分提高產(chǎn)量提高特異性模板濃度增加減少引物濃度高至75 pmol低至15 pmol引物長(zhǎng)度增加dNTPs各1 mmol/L各20 mmol/LTris-HCl (10 mmo

9、l/L pH8)pH高至10*pH高至10*MgCl2高至4 mmol/L1.5 mmol/LDMSO10%*甘油2%甲酰胺5%Taq DNA聚合酶*高至5U0.5U* 效果可能不可預(yù)測(cè)* 添加10% DMSO時(shí)，Taq DNA聚合酶的活性會(huì)被抑制47%，因此反應(yīng)加大Taq DNA聚合酶的用量（即5U）予以補(bǔ)償* Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut表2-2 可改變以提高PCR產(chǎn)物的特異性和/或產(chǎn)量的循環(huán)參數(shù)反應(yīng)條件提高產(chǎn)量提高特異性循環(huán)數(shù)最多35個(gè)減至25個(gè)變性*增至1 min引物退火*降至45升至72引物延伸*在后期循環(huán)中延長(zhǎng)維持30s* 使用基因組DNA作

10、模板時(shí)，開始幾個(gè)循環(huán)變性應(yīng)于97進(jìn)行* 假定Tm值為60* 延伸時(shí)間依產(chǎn)物大小而定：1000bp的產(chǎn)物延伸30s即可，產(chǎn)物更長(zhǎng)時(shí)，按每1000 bp延伸0.5 min計(jì)，在后期循環(huán)中增加延伸時(shí)間可以提高擴(kuò)增效率2引物的設(shè)計(jì)毫無(wú)疑問，引物的堿基組成，長(zhǎng)度及其靶序列的同源性是決定PCR成敗的首要因素，選擇設(shè)計(jì)引物在一定程度上仍然要靠經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于某一對(duì)引物而言尚無(wú)通用的規(guī)則可嚴(yán)，但應(yīng)遵守以下原則：（1）一般性原則：長(zhǎng)度：1530bp，其有效長(zhǎng)度 Ln=2 (G+C)+(A+T) 一般不大于38，否則PCR的最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq酶的最佳作用溫度（74），從而降低產(chǎn)物的特異性。GC含量：應(yīng)在45%55

11、%之間，PCR擴(kuò)增中的復(fù)性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去510度。引物長(zhǎng)度小于20時(shí)，其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。堿基分布的隨機(jī)性：應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的單一堿基。尤其是不應(yīng)在其3端出現(xiàn)3個(gè)的連續(xù)的G或C，否則會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。引物自身：不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物之間：兩個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基，不然會(huì)形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊。特異性：與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于70%，或少于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基。（2）引物的3端：引物的3端很大程度上影響Taq酶的延伸效應(yīng)，除特殊情況（AS-P

12、CR）外，3端不應(yīng)發(fā)生錯(cuò)配。S. Kwok等發(fā)現(xiàn)，引物的3端發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，A:A使產(chǎn)量下降至1/20，A:G或C:C下降至1/100。當(dāng)末位堿基是T時(shí)，即使錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的合成，而為A時(shí)錯(cuò)配的引發(fā)效率最低，G、C居間。因此，引物的3端堿基最好選用A、G、C，而盡可能地避免選用T，尤應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)2個(gè)以上的T。此外，如果擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物的3端不要終止于密碼子的第3位，因此處易發(fā)生簡(jiǎn)并，從而影響擴(kuò)增特異性。（3）避開引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)：某些引物無(wú)效的原因是引物重復(fù)區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，因此選擇擴(kuò)增片段時(shí)應(yīng)注意避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)，有些計(jì)算機(jī)軟件可幫助確定該區(qū)域，如不能避開，則可用7-deaza-2-脫氧GTP

13、取代dGTP，有助于PCR成功。目前在引物選擇中已廣泛應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件，從EMBL或Genebank中查找有關(guān)基因序列，并依據(jù)上述原則對(duì)所選用引物進(jìn)行評(píng)價(jià)。3出現(xiàn)異常結(jié)果時(shí)的解決思路在做PCR反應(yīng)的過(guò)程中，由于其酶促反應(yīng)的本質(zhì)，影響最終結(jié)果的因素較多，所以出現(xiàn)一些非預(yù)料的結(jié)果是可以理解的。下面簡(jiǎn)單地總結(jié)一下在PCR反應(yīng)結(jié)果出現(xiàn)異常時(shí)我們應(yīng)該采取的措施。（1）電泳檢查沒有PCR產(chǎn)物a需檢查一下Taq DNA聚合酶是否失活，或是活性太低，還需查一下在加樣過(guò)程中是否向體系中加過(guò)Taq DNA聚合酶；b需檢查一下所使用的引物，看其序列設(shè)計(jì)是否正確，是否堿基組成不平衡；c需要檢查一下PCR反應(yīng)過(guò)程中模板是

14、否變性充分，尤其在前幾個(gè)循環(huán)中是否變性充分；可以適當(dāng)?shù)靥岣吣０遄冃缘臏囟然蚴沁m當(dāng)延長(zhǎng)變性的時(shí)間；d需檢查一下在PCR反應(yīng)體系中是否有Taq DNA聚合酶的抑制劑，如SDS污染等等；e需檢查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的污染，可以預(yù)先加熱使之失活。（2）電泳檢查出現(xiàn)引物二聚體區(qū)帶a需檢查一下兩個(gè)引物的3端是否互補(bǔ)，或者是否有相類似的回文結(jié)構(gòu)；b需檢查一下使用的引物是否太短，可以予以適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)；c需檢查模板的用量，模板以104個(gè)拷貝為最佳，模板太少會(huì)造成引物相對(duì)過(guò)量；d適當(dāng)?shù)亟档鸵锏臐舛?，引物濃度過(guò)高是出現(xiàn)引物二聚體的最主要原因；e循環(huán)次數(shù)太多也易形成引物二聚體，可以適當(dāng)?shù)販p少循環(huán)數(shù)；f可以將

15、復(fù)性溫度提高一些以減少引物二聚體形成。（3）電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物呈片狀（smear）a需檢查一下Taq DNA聚合酶的用量，適當(dāng)?shù)販p少Taq酶的量有助于特異性條帶擴(kuò)增；b可以提高反應(yīng)的退火溫度，或者直接采用兩個(gè)溫度的PCR（68退火和延伸，94模板變性）；c適當(dāng)?shù)亟档蚆g2+的濃度也可起到降低非特異性擴(kuò)增可能性的作用；d適當(dāng)?shù)販p少反應(yīng)退火的時(shí)間和延伸的時(shí)間；e適當(dāng)?shù)販p少循環(huán)次數(shù)也會(huì)有效果；f可以嘗試使用巢式引物PCR（nested primer PCR）。（4）電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物出現(xiàn)其它非特異性條帶a需檢查一下引物的3端是否有連續(xù)排列的G或C；b可以適當(dāng)?shù)靥岣咄嘶饻囟然蛑苯硬捎脙刹綔囟萈CR方法

16、進(jìn)行擴(kuò)增；c可以降低Taq DNA聚合酶的用量，同時(shí)也降低引物的濃度；d可以適當(dāng)?shù)販p少退火所用的時(shí)間以及延伸反應(yīng)的時(shí)間；e可以適當(dāng)?shù)卦黾踊驕p少一些Mg2+濃度。4假陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)中設(shè)立的陰性對(duì)照可提示有無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。如果一次實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)陰性對(duì)照中出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，提示本次實(shí)驗(yàn)中其它標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果可能有假陽(yáng)性。造成假陽(yáng)性的原因包括樣品污染、擴(kuò)增試劑污染、擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染等。常見的污染來(lái)源包括實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、加樣器、操作中形成的噴霧、DNA抽提儀器、試劑及任何與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸的東西。預(yù)防各種污染的措施主要有：（1）工作區(qū)隔離。（2）改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作，如在加樣過(guò)程中避免試劑飛濺、吸頭離心管使用前高壓處理、試劑分裝成小份一次使用后棄去等。（3）操作程序合理化，如后加陽(yáng)性對(duì)照等。交叉污染的處理方法包括：（1）在DNA模板和多聚酶加入前，紫外線照射反應(yīng)管內(nèi)容物以破壞污染的PCR產(chǎn)物。一般選用波長(zhǎng)254nm照射30min（Nature, 1990, 34:27）。（2）PCR實(shí)驗(yàn)中使用dUTP，而不用dTTP。在擴(kuò)增前使用UraciN-glycosylase（尿嘧啶糖基化酶）處理可降解交叉污染的PCR產(chǎn)物，而不降解基因組DNA模板，然后熱滅活此酶，再進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)（Gene, 1990, 93: 125）。美國(guó)PE公司提供此類試劑盒（PCR carry-over