分解纖維素的菌的分離與提純

1、降解纖維素菌株的篩選降解纖維素菌株的篩選及降解能力的比較及降解能力的比較指導(dǎo)老師：指導(dǎo)老師：xxx班班 級(jí)：級(jí)：xxx組組 長(zhǎng)：長(zhǎng)：xxx組組 員：?jiǎn)T：xxx xxx 目的意義 實(shí)驗(yàn)用品 實(shí)驗(yàn)方法與流程 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分析與討論 致謝目的意義 能源危機(jī)、環(huán)境污染日益嚴(yán)重，在邁入21世紀(jì)今天，已成為人類面臨的兩大難題。尋找新能源，減少環(huán)境污染，越來越顯得重要。纖維素是植物光合作用的主要產(chǎn)物，利用微生物可將纖維材料轉(zhuǎn)化為能源、飼料、化工等原料。 篩選出降解纖維素的菌株有助于投入生產(chǎn)，在能源、工業(yè)生產(chǎn)等作為理論參考。實(shí)驗(yàn)用品培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（初篩培養(yǎng)基） ： CMC-Na 3.0g (NH4

2、)2SO4 2.0g K2HPO4 1.0g MgSO47H2O 0.5g 胰蛋白胨 1.0g 瓊脂 20g剛果紅培養(yǎng)基（復(fù)篩培養(yǎng)基）：CMC-Na 3.0g (NH4)2SO4 2.0g K2HPO41.0g MgSO47H2O 0.5g 胰蛋白胨 1.0g 瓊脂 20g 剛果紅 0.0692g 水 1000ml PH 7.0 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0g (NH4)2SO4 4.0g KH2PO4 2.0 MgSO4.7H2O 0.5g H2O 1000ml PH 6.0主要儀器：紫外分光光度計(jì) UV-2550型高速離心機(jī) HC-2518型主要試劑：3,5-二硝基水楊酸羧甲基纖

3、維素鈉實(shí)驗(yàn)方法與流程樣品采集初篩復(fù)篩酶活力測(cè)定取文匯山落葉覆蓋下的腐殖土、延河河泥 將土樣按濃度梯度配置成菌懸液，取1ml涂布到以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的平板上，與培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，多次平板劃線分離純化得到純菌株 。將初篩得到的菌株點(diǎn)樣于剛果紅培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)篩，,培養(yǎng)2d。采用十字交叉取平均值法，測(cè)量降解圈及菌落直徑R1，R2。根據(jù)R1/R2的值，篩選出比值最大的幾株菌。還原糖測(cè)定為DNS試劑法540nm處有最大吸光值，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)弱成比例關(guān)系。根據(jù)產(chǎn)生葡萄糖的量間接作為酶活力衡量標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配置1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，取9只具塞試管，分別編號(hào)0、1、2、3

4、、4、5、6、7、8，按下表加量：項(xiàng)目012345678葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液/ml00.20.40.60.81.01.21.41.6相當(dāng)于葡萄糖量/mg00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸餾水/ml2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNS試劑/ml1.51.51.51.51.51.51.51.51.5酶活力測(cè)定具體步驟:粗酶液的提取 取10mL試管，加入 6mL1.0%羧甲基纖維素鈉溶液，再加入不同菌株提取的粗酶液，50水浴中酶解30min，加2.0mLDNS溶液，沸水浴8min，取出于冷水中冷卻至室溫，定容10.0mL，在540nm下測(cè)吸光值 混勻后，放入沸水中，

5、準(zhǔn)確沸水浴8分鐘，取出冷卻至室溫，加入21.5ml蒸餾水，以0號(hào)為對(duì)照在540nm下測(cè)定其OD值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線用接種環(huán)從試管里取一環(huán)活化后的菌株，加入到產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每隔一天取一定培養(yǎng)液，離心（8000r/min,10min）取上清液，即為粗酶液。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過多次分離純化，共分離出9株菌；接種到剛果紅培養(yǎng)基上篩選名稱 ML-1SX-2WZ-3WX-4WD-5LT-6LH-7BF-8ZP-9降解圈直徑R1(cm)1.61.21.451.52.11.351.351.651.55菌落直徑R2 (cm)0.350.40.360.350.30.320.320.320.42R1/R24.5

6、73.004.034.277.004.224.225.163.69十字交叉法測(cè)得菌落及降解圈的直徑如下表：由表中數(shù)據(jù)，挑選出ML-1，WD-5,BF-8R1/R2比值最大的三株菌對(duì)所篩出的三株菌進(jìn)行鏡檢得到圖片如下：ML-1WD-5BF-8ML-1WD-5BF-8革蘭氏染色結(jié)果陰性（紅色)陽(yáng)性(藍(lán)紫色)陰性(紅色)細(xì)菌形態(tài)桿狀桿狀桿狀WD-5BF-8WD-5WD-5BF-8WD-5WD-5BF-8WD-5WD-5BF-8WD-5生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果ML-1WD-5BF-8VP實(shí)驗(yàn)-+-MR實(shí)驗(yàn)+吲哚實(shí)驗(yàn)-產(chǎn)酸+產(chǎn)氣-淀粉實(shí)驗(yàn)+葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖：酶活力測(cè)定結(jié)果：由圖可知ML-1菌

7、株在第五天時(shí)，酶活力最強(qiáng)，為0.20099；WD-5菌株在第二天時(shí)酶活力最強(qiáng)，為0.1860；BF-8菌株在第四天時(shí)酶活力最強(qiáng)，為0.1935。據(jù)此分析WD-5酶活下降較快，ML-5菌株酶活力最強(qiáng) 分析與討論： 本次試驗(yàn)由于時(shí)間等方面條件限制，只做了單一株菌的酶活力測(cè)定，但我們很清楚纖維素酶是一種復(fù)合酶系，自然狀態(tài)下,纖維素的徹底降解是在微生物體系中多種微生物長(zhǎng)時(shí)間相互作用的結(jié)果，微生物種群間存在著協(xié)同作用。所以降解纖維素菌株混合優(yōu)化培養(yǎng)是個(gè)需要深入研究的課題。 通常認(rèn)為產(chǎn)生較大透明圈的菌株,降解纖維素能力也較高,但本試驗(yàn)結(jié)果表明溶解圈大小不能完全代表菌株的纖維素酶活力,ML-1菌種降解圈不是最大，但是其酶活力卻是最高的。這也說明僅以溶解圈大小作為纖維素酶活力大小的定量指標(biāo)是不太可靠的,其原因可能是多方面的,如固體和液體培養(yǎng)條件不同;同一發(fā)酵時(shí)間和酶作用溫度不一定是每一株菌的最佳產(chǎn)酶時(shí)間和最適作用溫度,不同菌株具有不同的纖維素酶系等。分析與討論： 由酶活力曲線可以看出,每天測(cè)一次酶活力,實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng),對(duì)酶活力的精確測(cè)定有影響,以后測(cè)酶活可將時(shí)間間隔定位12小時(shí)或更短時(shí)間,把酶活力測(cè)得更為精確，這也是我們操作技術(shù)有待進(jìn)一步提高，實(shí)驗(yàn)思想需要改進(jìn)的地方。目前，處理農(nóng)作物秸稈的方式還只是簡(jiǎn)單作為牲畜飼料、燃料等初步利用的階段。利用微生物降解纖維素的方法還未推廣開