IPTG誘導(dǎo)原理

1、乳糖操縱子的誘導(dǎo)原理 中心法則中心法則(the central dogma)DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄RNA復(fù)制基因表達(dá)基因表達(dá)(gene expression)-基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程。產(chǎn)生各基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程。產(chǎn)生各種種RNA(tRNA、mRNA、rRNA)和各種蛋白質(zhì)多肽鏈。和各種蛋白質(zhì)多肽鏈。RNA(tRNA、mRNA和和rRNA 基因的表達(dá)方式 根據(jù)生物對內(nèi)外環(huán)境刺激的反應(yīng)，將根據(jù)生物對內(nèi)外環(huán)境刺激的反應(yīng)，將基因表達(dá)的方式分為：基因表達(dá)的方式分為： 組成型表達(dá) 誘導(dǎo)和阻遏表達(dá)組成型表達(dá)組成型表達(dá) （constitutive gene expression） 在個(gè)體發(fā)育的任一

2、階段都能在個(gè)體發(fā)育的任一階段都能在大多數(shù)細(xì)胞中在大多數(shù)細(xì)胞中持續(xù)進(jìn)行持續(xù)進(jìn)行的基因的基因表達(dá)，表達(dá)，無論表達(dá)的水平高或低無論表達(dá)的水平高或低，它，它受環(huán)境因素的影響較少受環(huán)境因素的影響較少、或變化或變化很小很小。 且基因表達(dá)產(chǎn)物通常是對且基因表達(dá)產(chǎn)物通常是對生命過程生命過程必需必需的、必不可少的，的、必不可少的，這類基因通常被稱為持家基因這類基因通常被稱為持家基因（housekeeping gene）。）。誘導(dǎo)和阻遏表達(dá)誘導(dǎo)和阻遏表達(dá)誘導(dǎo)誘導(dǎo)（induction）：）：在在特定的環(huán)境信號特定的環(huán)境信號刺激下，相應(yīng)基因被激刺激下，相應(yīng)基因被激活，從而使基因的活，從而使基因的表達(dá)產(chǎn)物增加表達(dá)產(chǎn)物增

3、加。這類基因稱為可誘導(dǎo)基因。這類基因稱為可誘導(dǎo)基因。 可誘導(dǎo)基因在特定環(huán)境中表達(dá)增強(qiáng)的過程，稱為可誘導(dǎo)基因在特定環(huán)境中表達(dá)增強(qiáng)的過程，稱為誘導(dǎo)誘導(dǎo) (induction)。乳糖乳糖 利用乳糖的三種酶表達(dá)利用乳糖的三種酶表達(dá)阻遏（阻遏（repression）：）：在在特定環(huán)境信號特定環(huán)境信號刺激下，相應(yīng)基因被抑制，刺激下，相應(yīng)基因被抑制，從而使基因的從而使基因的表達(dá)產(chǎn)物減少表達(dá)產(chǎn)物減少。這類基因稱為可阻遏基因。這類基因稱為可阻遏基因?？勺瓒艋虮磉_(dá)產(chǎn)物水平降低的過程稱為可阻遏基因表達(dá)產(chǎn)物水平降低的過程稱為阻遏阻遏 (repression）。）。 協(xié)調(diào)表達(dá)協(xié)調(diào)表達(dá)(coordinate expre

4、ssion) 在一定機(jī)制控制下，功能上相關(guān)的一組在一定機(jī)制控制下，功能上相關(guān)的一組基因，無論其為何種表達(dá)方式，均需基因，無論其為何種表達(dá)方式，均需協(xié)調(diào)協(xié)調(diào)一致、共同表達(dá)一致、共同表達(dá)，使各表達(dá)產(chǎn)物的分子比，使各表達(dá)產(chǎn)物的分子比例適當(dāng)，從而正常發(fā)揮功能。這種現(xiàn)象稱例適當(dāng)，從而正常發(fā)揮功能。這種現(xiàn)象稱為協(xié)調(diào)表達(dá)為協(xié)調(diào)表達(dá) (coordinate expression)，這，這種調(diào)節(jié)稱為協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)種調(diào)節(jié)稱為協(xié)調(diào)調(diào)節(jié) (coordinate regulation)。乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能操縱子模型的提出操縱子模型的提出 1960-1961年，年，莫洛莫洛(Monod)(Monod)和雅各布和雅各布(Ja

5、cob)(Jacob)首次提出首次提出“操縱子操縱子”學(xué)說。學(xué)說。 獲獲19651965年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 1940年，年， Monod發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長時(shí)，細(xì)菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源轉(zhuǎn)長時(shí)，細(xì)菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源轉(zhuǎn)變期，細(xì)菌的生長會出現(xiàn)停頓。即產(chǎn)生變期，細(xì)菌的生長會出現(xiàn)停頓。即產(chǎn)生“二次生長曲線二次生長曲線”。操縱子（操縱子（operon)：很多很多功能相關(guān)功能相關(guān)的的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)排列在染色體排列在染色體上，由一個(gè)上，由一個(gè)共同的控制區(qū)共同的控

6、制區(qū)來操縱這些基因的表達(dá)，包含這些結(jié)構(gòu)基來操縱這些基因的表達(dá)，包含這些結(jié)構(gòu)基因和控制區(qū)的整個(gè)核苷酸序列就稱為操縱子。因和控制區(qū)的整個(gè)核苷酸序列就稱為操縱子。 操縱子的組成： -結(jié)構(gòu)基因(structural gene, SG) ：操縱元中被調(diào)控的編碼蛋白質(zhì)的基因 -啟動子(promoter，P)：是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。 -操縱基因(operator，O)：是指能被調(diào)控蛋白特異性結(jié)合的一段DNA序列。阻遏物基因(inhibitor,I),產(chǎn)生阻遏物(repressor)。乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能 三個(gè)特異性序列：三個(gè)特異性序列： 操縱序列操縱序列 O (op

7、erator): 阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)。阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)。 啟動子啟動子 P (promoter): 位于結(jié)構(gòu)基因的上游。位于結(jié)構(gòu)基因的上游。 CAP結(jié)合位點(diǎn)：環(huán)結(jié)合位點(diǎn)：環(huán)cAMP受體蛋白受體蛋白(分解代謝物激活蛋白分解代謝物激活蛋白)結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合位點(diǎn)。 一個(gè)調(diào)節(jié)基因一個(gè)調(diào)節(jié)基因llac I：編碼阻遏蛋白，能結(jié)合于操縱序列位點(diǎn)。：編碼阻遏蛋白，能結(jié)合于操縱序列位點(diǎn)。乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 Z編碼編碼-半乳糖苷酶：半乳糖苷酶：將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。 Y編碼編碼-半乳糖苷透過酶：半乳糖苷透過酶：使外界的使外界的-半乳糖苷（如乳糖）半乳糖苷（如乳糖）

8、能透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。能透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 A編碼編碼-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶：半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶：乙酰輔酶乙酰輔酶A上的乙酰基轉(zhuǎn)上的乙?；D(zhuǎn)到到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能 當(dāng)一個(gè)mRNA含有編碼一個(gè)以上蛋白質(zhì)的編碼信息，而且這些蛋白質(zhì)都是以獨(dú)立的多肽被翻譯時(shí)，這樣的mRNA稱之多順反子mRNA。 多順反子mRNA在細(xì)菌中是很普遍的。 多順反子lac mRNA中的lacZ，lacY，lacA經(jīng)翻譯生成的產(chǎn)物分別生成代謝分解乳糖的三種酶 始終存在著一定的比例關(guān)系( Z : Y : A = 5 : 2

9、: 1 )乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能 lacZ、Y、A基因的轉(zhuǎn)錄是由lacI基因指令合成的阻遏蛋白R所控制。lacI一般和結(jié)構(gòu)基因相毗連，但它本身具有自己的啟動子和終止子，成為獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位。 由于lacI的產(chǎn)物是可溶性蛋白，按照理說是無需位于結(jié)構(gòu)基因的附近。它是能夠分散到各處或結(jié)合到分散的DNA位點(diǎn)上。乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和功能阻遏蛋白的阻遏蛋白的負(fù)負(fù)調(diào)控調(diào)控 (negative control of repressor)阻遏蛋白的阻遏蛋白的負(fù)負(fù)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)(negative control of repressor) 無乳糖無乳糖(no lactose):(no lactose)

10、: lac lac操縱元處于阻操縱元處于阻遏狀態(tài)遏狀態(tài)(repression)(repression) 有乳糖有乳糖(presence of lactose)(presence of lactose)：laclac操操縱元即可被誘導(dǎo)縱元即可被誘導(dǎo)(derepression,induction)(derepression,induction) 誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)劑(inducer):(inducer): 別乳糖、半乳糖、別乳糖、半乳糖、IPTGIPTG（異丙基硫代半乳糖苷）（異丙基硫代半乳糖苷）The Lac Operon:When Glucose Is Present But Not LactoseR

11、epressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.RepressorRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCome on, let me throughNo way!CAPCAPThe Lac Operon:When Lactose Is Present But Not GlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveLacRepr

12、essorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeYeah!RNAPol.RNAPol. 乳糖操縱子的調(diào)控機(jī)理乳糖操縱子的調(diào)控機(jī)理乳糖操縱子誘導(dǎo)物別乳糖別乳糖(allolactose)是誘導(dǎo)物是誘導(dǎo)物為什么選用IPTG作誘導(dǎo)物？ 能誘導(dǎo)酶的合成，但又不被分解的分子,稱為安慰誘導(dǎo)物（gratuitous inducer）。 由于乳糖雖可誘導(dǎo)酶的合成，但又隨之分解，產(chǎn)生很多復(fù)雜的動力學(xué)問題，因此人們常用安慰誘導(dǎo)物來進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。 X-gal（5-溴-4-錄-3-吲哚-半乳糖苷）也是一種人工化學(xué)合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解產(chǎn)生蘭色化合物，因

13、此可以用作 半乳糖苷酶活性的指示劑。IPTG和X-gal都被廣泛應(yīng)用在分子生物學(xué)和基因工程的工作中。 為什么選用IPTG作誘導(dǎo)物？ 某些誘導(dǎo)物與自然的-半乳糖苷酶相似，且不能被酶分解，比如異丙基-D-硫代半乳糖苷，（isopropylthiogalactoside,IPTG）。不被細(xì)菌分不被細(xì)菌分解性質(zhì)穩(wěn)定，解性質(zhì)穩(wěn)定，它的濃度在實(shí)驗(yàn)中不會改變。 復(fù)雜的動力學(xué)問題，便于研究。 IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被運(yùn)送。為什么選用IPTG作誘導(dǎo)物？乳糖（葡萄糖-1，4-D-半乳糖苷） 半乳糖苷鍵中用半乳糖苷鍵中用硫硫代替了代替了氧氧，失去了水解活性，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代

14、化合物與酶位點(diǎn)但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物與酶位點(diǎn)的親和力相同，的親和力相同，IPTG雖不為雖不為-半乳糖苷酶所識半乳糖苷酶所識別，但它是別，但它是lac基因簇十分有效的誘導(dǎo)物。基因簇十分有效的誘導(dǎo)物。乳糖操縱子的乳糖操縱子的CAP正調(diào)控正調(diào)控（Positive Control of CAPPositive Control of CAP） CAP(catabolite activator protein)(catabolite activator protein) - -分解代謝基因激活蛋白分解代謝基因激活蛋白 又稱為又稱為 CRP (cAMP receptor protein), (cA

15、MP receptor protein), laclac operon operon高水平轉(zhuǎn)錄高水平轉(zhuǎn)錄必需必需的一個(gè)的一個(gè)激活蛋白激活蛋白。 CAP( (同二聚體同二聚體),),含含 DNA結(jié)合區(qū)結(jié)合區(qū) 以二聚體的方式與特定的以二聚體的方式與特定的DNADNA序列結(jié)合序列結(jié)合 cAMP結(jié)合區(qū)結(jié)合區(qū)與與cAMPcAMP特異結(jié)合，并發(fā)生空特異結(jié)合，并發(fā)生空間構(gòu)象的變化間構(gòu)象的變化, ,形成形成cAMP-CAPcAMP-CAP復(fù)合物（有活性復(fù)合物（有活性）乳糖操縱子的乳糖操縱子的CAP正調(diào)控正調(diào)控（Positive Control of CAPPositive Control of CAP） 當(dāng)當(dāng)

16、CAP與與CAP結(jié)合位點(diǎn)這段序列結(jié)合時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)這段序列結(jié)合時(shí)，可激活可激活RNA轉(zhuǎn)錄酶活性，使之提高轉(zhuǎn)錄酶活性，使之提高50X 葡萄糖葡萄糖 降解產(chǎn)物降解產(chǎn)物 ATP cAMP 5AMPCRP（非活性狀態(tài)）（非活性狀態(tài)） CAP（活性狀態(tài)）（活性狀態(tài)）乳糖操縱子的乳糖操縱子的CAP正調(diào)控正調(diào)控（Positive Control of CAPPositive Control of CAP）+ + + + + + + + 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄無葡萄糖，無葡萄糖，cAMP濃度高時(shí)濃度高時(shí)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄促進(jìn)轉(zhuǎn)錄有葡萄糖，有葡萄糖，cAMP濃度低時(shí)濃度低時(shí)不促進(jìn)轉(zhuǎn)錄不促進(jìn)轉(zhuǎn)錄CAPZYAOPDNACAPCAPCAPCA

17、PCAP乳糖操縱子的乳糖操縱子的CAP正調(diào)控正調(diào)控（Positive Control of CAPPositive Control of CAP） 葡萄糖效應(yīng)：當(dāng)細(xì)菌在含有葡萄糖套和乳糖的培養(yǎng)基中生長時(shí)，通常優(yōu)先利用葡萄糖。只有當(dāng)葡萄糖消耗完，經(jīng)過一段停滯期，在乳糖的誘導(dǎo)下半乳糖苷酶開始合成，細(xì)菌才能充分利用乳糖。 葡萄糖的降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，并活化磷酸二脂酶，因而降低 cAMP的濃度。 所以葡萄糖存在時(shí)，cAMP濃度低；僅在葡萄糖消耗完畢時(shí), cAMP濃度增高，CAP-cAMP 復(fù)合物形成（結(jié)合于lac operon CAP結(jié)合位點(diǎn))，才會促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。乳糖操縱子的乳糖操縱子的協(xié)調(diào)調(diào)控

18、調(diào)控 (coordinate regulation) 由于Plac是弱啟動子，單純因乳糖的存在發(fā)生去阻遏使lac操縱元轉(zhuǎn)錄開放，還不能使細(xì)菌很好利用乳糖，必需同時(shí)有CAP來加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，細(xì)菌才能合成足夠的酶來利用乳糖。關(guān)鍵條件：lac操縱元的強(qiáng)誘導(dǎo)既需要有乳糖的存在又需要沒有葡萄糖可供利用。Lac操縱子基因表達(dá)受阻遏蛋白和操縱子基因表達(dá)受阻遏蛋白和CAP的雙重調(diào)控的雙重調(diào)控The Lac Operon:When Lactose Is Present But Not GlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRe

19、pressor mRNAHey man, Im constitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseYeah!RNAPol.RNAPol.The Lac Operon:When Neither Lactose Nor Glucose Is PresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingCAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveRepressorSTOPRight therePolymeraseCome on, let me through !Alright, Im off to the races . . .Lac操縱子基因表達(dá)受阻遏蛋白和操縱子基因表達(dá)受阻遏