非甾類同化激素類藥殘留量測(cè)定方法（二）

1、非甾類同化激素類藥殘留量測(cè)定方法（二） (5)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，hplc) hplc是殘留分析的國(guó)際公認(rèn)辦法，挑選性強(qiáng)、敏捷度高。但是，由于樣品前處理步驟較多，操作繁瑣，分析時(shí)光長(zhǎng)，不宜于殘留檢測(cè)的迅速篩選。近年來(lái)，在hplc基礎(chǔ)上進(jìn)展起來(lái)的超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，uplc)，是基于小顆粒填料的一種創(chuàng)新技術(shù)，它同時(shí)實(shí)現(xiàn)了高分別度、高敏捷度和高分析速度，目前也已經(jīng)應(yīng)用于非甾類同化激素的殘留分析。非甾類同化激素hplc檢測(cè)主要采納紫外檢測(cè)器(ultra

2、violet detector，uvd)、二極管陣列檢測(cè)器(diode-array detector，dad；photo-diode array detector，pda)、熒光檢測(cè)器(fluorescence detector，fld)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light scattering detector，elsd)以及電化學(xué)檢測(cè)器(electrochemical detector，ecd)等。 1)uvd，dad/pda uvd是hplc辦法中常用的檢測(cè)器。非甾類同化激素的分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基和碳碳雙鍵、酮基及酚羥基組成的長(zhǎng)共軛體系，可以溶于稀堿溶液，在240300

3、nm有較強(qiáng)的uv汲取。 劉宏程等建立了hplc-uvd法分析牛奶中des、hes和dis。采納mspd技術(shù)提取和凈化，以20mmol/l磷酸-(42+58，v/v)為流淌相，在xterra c18(250mm×4.6mm，5m)色譜柱上分別；或者，以20mmol/l-乙腈(60+40，v/v)為流淌相，在hypersilc18(250mm×4.6mm，5m)色譜柱上分別；流速1.0ml/min，柱溫30，進(jìn)樣20l，紫外波長(zhǎng)230nm檢測(cè)。3種雌激素的平均回收率為84.1%93.5%，rsd為3.5%7.8%；des、hes和dis的lod分離為0.004mg/kg、0.0

4、04mg/kg和0.006mg/kg，loq分離為0.01mg/kg、0.01mg/kg和0.02mg/kg。 張清杰等采納hplc-uvd法檢測(cè)牛奶和奶粉中的zer、tal、zan、zon、ax-zol和-zol。樣品用乙腈提取，iac柱凈化，hplc-uvd檢測(cè)。色譜柱為cloversil-c18(4.6mm×250mm)，流淌相為乙腈-水(43+7+50，v/v)，流速為0.80ml/min，柱溫為室溫，波長(zhǎng)為265nm，進(jìn)樣量為20l。牛奶和奶粉中zer、tal、zan、zon、a-zol和-zol的添加回收率均為80%110%，cv均小于12%；牛奶的lod為2.0g/l，

5、奶粉的lod為0.4g/kg。方曉明等建立了hplc-uvd測(cè)定雞肝中zer的辦法。樣品經(jīng)水解，提取，抽提，c18固相萃取柱凈化后，用zorbax sb-pheny1柱(250mm×416mmi.d.，5m)分別，以乙腈-0.3%三氟乙酸水溶液(40+60，v/v)為流淌相，流速為0.80ml/min，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10l，262nm波特長(zhǎng)檢測(cè)。辦法平均回收率為72.0%80.4%，cv為8.3%13.9%，loq為5g/kg。 koole等報(bào)道了采納hplc-dad同時(shí)測(cè)定牛尿中20種同化激素(包括類和rals)的分析辦法。用rp-select b色譜柱分別，乙腈-水為流淌相

6、，梯度洗脫，乙腈比例根據(jù)凹形曲線由43%升高到76%，各藥物獲得良好分別。以標(biāo)準(zhǔn)溶液校正的保留時(shí)光和uv光譜圖定性，降低了標(biāo)準(zhǔn)偏差原始值的約25%。辦法lod在510ng之間。 2)fld fld具有較強(qiáng)的挑選性和較高的敏捷度，是殘留分析中常采納的檢測(cè)器。des等二苯乙烯類需要衍生化才可以用fld檢測(cè)，文獻(xiàn)報(bào)道很少；rals中惟獨(dú)zon、a-zol、-zol可以用fld檢測(cè)。 chen等等采納4-(4，5-diphenyl-1himidazol-2-yl)benzoyl chloride (dib-cl)為衍生化試劑，建立了尿液中des的hplc-fld檢測(cè)辦法。0.5ml尿液樣品中加入0.0

7、5ml濃鹽酸，80水解60min，待室溫后加入200ml 3mol/l naoh中和，c18柱凈化，3ml乙酸乙酯洗脫，40水浴中氮?dú)獯蹈桑?00ul復(fù)溶，再加入200l 2.5mmol/l dib-ci乙腈溶液和3l 3mol/l三乙胺乙腈溶液于40衍生化30min，用20l 1mol/l hcl溶液終止反應(yīng)，取20l hplc分析。c18色譜柱(250mm×4.6mm，5m)分別，流淌相為-水(96+4，v/v)，流速為1.0ml/min，采納程序熒光檢測(cè)：08.5min，激發(fā)波長(zhǎng)(ex)為200nm、放射波長(zhǎng)(em)為300nm；8.520min，ex為350nm、em為460

8、nm。結(jié)果，des的lod為0.5ng/ml，回收率為78.5%88.3%，cv低于6.4%。 shin等建立了hplc-fld辦法檢測(cè)老鼠血清中的zon。血清樣品經(jīng)提取，hplc-fld分析，以為乙腈-0.1%三乙胺溶液(ph6，50+50，v/v)為流淌相，在c18色譜柱(250mm×4.6mmi.d，5m)上分別，ex和em分離為246nm和460nm。該辦法回收率為79.3%96.2%，日內(nèi)和日間cv低于12.1%，loq為10ng/ml。 3)elsd elsd是一種通用型的檢測(cè)器，可檢測(cè)揮發(fā)性低于流淌相的任何樣品，而無(wú)需發(fā)色基團(tuán)。elsd的響應(yīng)值與樣品的質(zhì)量成正比，因而能

9、用于測(cè)定樣品的純度或者檢測(cè)未知物。elsd敏捷度比示差折光檢測(cè)器高，對(duì)溫度變幻不敏感，基線穩(wěn)定，適合于hplc梯度洗脫。江勇等建立了hplc-elsd檢測(cè)肉產(chǎn)品中des等藥物的殘留分析辦法。稱取樣品5g于具塞三角瓶中，加甲醇10.0ml，超聲處理10min，取上清液離心后用hplc-elsd分析。經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定hplc和elsd的條件：色譜柱diamonsil tm c18 ods(250mm×4.6mm.i.d，5um)，流淌相為5%乙酸和乙腈，梯度洗脫，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量10l，柱溫30；elsd增益值為7，溫度40，載氣為空氣，壓力3.4bar。按信噪比(s/n)為3計(jì)

10、算，該辦法des的lod為0.0058mg/kg，回收率為85.2%，cv為3.18%。 4)ecd ecd是測(cè)量物質(zhì)的電信號(hào)變幻。具有氧化還原性質(zhì)的化合物，如含硝基、氨基等有機(jī)化合物以及無(wú)機(jī)陰、陽(yáng)離子等物質(zhì)，均可采納ecd檢測(cè)。ecd又包括極譜、庫(kù)侖、安培和電導(dǎo)檢測(cè)器等，前三種統(tǒng)稱為伏安檢測(cè)器，用于具有氧化還原性質(zhì)化合物的檢測(cè)，而電導(dǎo)檢測(cè)器主要用于離子檢測(cè)。 reuvers等用hplc-ecd檢測(cè)動(dòng)物可食用組織中的des殘留。組織樣品先用叔丁基甲醚提取，1mol/l氫氧化鈉再次提取，用c18固相萃取柱凈化，以甲醇-0.05mol/l磷酸緩沖液(ph3.5)(67+33，v/v)為流淌相，在nucleosil c18色譜柱分別，ecd在+0.90v檢測(cè)。該辦法lod為0.52.0g/kg，回收率為66%。萬(wàn)美梅等建立了動(dòng)物組織中des的hplc-ecd檢測(cè)辦法。色譜柱為hypersil ods c18柱(5um，4.6mm×250mm)，流淌相為乙腈-0.007mol/l(48+52，v/v，ph3.5)，柱溫為32，流速為1.0ml/min。ecd參數(shù)設(shè)置：模式為前處理(pretreat)，工作電位0.9v，前處理控制設(shè)為停止，零點(diǎn)控制設(shè)為預(yù)備，后時(shí)光30min，前處理循環(huán)8次，前處理電位1為1.4v，前處理電位2為-0.4v，前處理時(shí)