食品中黃曲霉毒素

1、食品中黃曲霉毒素 (aflatoxin，簡(jiǎn)稱af)是和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，目前已分別鑒定出20多種，主要是黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、g1、黃曲霉毒素g2以及由黃曲霉毒素b1和黃曲霉毒素b2在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素m1、黃曲霉毒素m2等。黃曲霉毒素的基本結(jié)構(gòu)為二呋喃香豆素衍生物，在紫外光下，黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2發(fā)藍(lán)紫色熒光，黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2 發(fā)黃綠色熒光。黃曲霉毒素耐熱，可溶于、等有機(jī)溶劑，不溶于水、和。普通在中性及酸性溶液中較穩(wěn)定，在ph 910的強(qiáng)堿性溶液中快速分解。黃曲霉毒素b1的分解溫度為268，紫外線

2、對(duì)低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性。 因?yàn)辄S曲霉毒素是一類毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，1993年被世界衛(wèi)生組織的癌癥討論機(jī)構(gòu)劃定為i類致癌物。黃曲霉毒素的危害性在于對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用，表現(xiàn)為肝細(xì)胞變性、壞死，終于導(dǎo)致器官嚴(yán)峻損傷。 黃曲霉的最適產(chǎn)毒溫度為2532。我國(guó)產(chǎn)生黃曲霉毒素的產(chǎn)毒菌株主要分布在華中、華南和華東地區(qū)，產(chǎn)毒量也較高，經(jīng)常存在于動(dòng)植物性食品，各種堅(jiān)果，糧油及其制品，如花生、胡桃、杏仁、大豆、稻谷、玉米、調(diào)味品、乳制品、食用油等制品中也常常發(fā)覺黃曲霉毒素。我國(guó)規(guī)定了食品中黃曲霉毒素的允許限量花生、玉米為20 ug/ kg，乳及乳制品為0.5ug/kg，豆類、發(fā)酵食品為5 ug/

3、g。 黃曲霉毒素的檢測(cè)辦法包括：薄層色譜法(tlc)、高效液相色譜法(hplc)、微柱篩選法、酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)、免疫親和柱-熒光分光光度法、免疫親和柱-hplc法等。本試驗(yàn)主要介紹免疫親和柱-熒光分光光度法和免疫親和柱凈化-高效液相色譜法。 (一)免疫親和柱-熒光分光光度法 1檢測(cè)原理 樣品中的黃曲霉毒素用一定比例的甲醇一水提取，提取液經(jīng)過過濾、稀釋后，用免疫親和柱分別凈化，以甲醇將親和柱上的黃曲霉毒素淋洗下來，在淋洗液中加入溴溶液衍生，以提高測(cè)定敏捷度，然后用熒光分光光度計(jì)舉行定量測(cè)定。 2主要試劑及儀器 真菌毒素專用熒光分析儀；黃曲霉毒素免疫親和柱；0.03的溴溶液；熒光分析儀

4、校準(zhǔn)溶液：3.4g二水硫酸奎寧，用0.05mol/l稀硫酸稀釋至100ml。 、(色譜級(jí))、重蒸餾水、1.5um的玻璃纖維濾紙。 3檢測(cè)步驟 (1)標(biāo)定熒光計(jì)配制0.003%溴衍生溶液(天天配制)：取5 ml 0.03的溴溶液，加入45 ml的蒸餾水；：水(60 : 40，體積比)溶液；試劑對(duì)比實(shí)驗(yàn)(1ml+ 1ml 0.003%溴衍生液置于測(cè)試管中)，熒光計(jì)讀數(shù)應(yīng)為0;純水對(duì)比試驗(yàn)(2ml純水置于測(cè)試管中)，熒光計(jì)讀數(shù)應(yīng)為。 (2)毒素提取稱取25 g樣品，5g氯化鈉，置于攪拌杯中，加入125 ml甲醇：水(60 : 40)溶液，蓋上杯蓋高速攪拌1 min后將提取物倒入折疊式濾紙上，濾液收集

5、于千凈的容器中。吸取20ml濾液，置于整潔的容器中，用20 ml蒸餾水稀釋，混勻。經(jīng)過玻璃纖維濾紙過濾，濾液收集于玻璃注射管中。 (3)親和柱操作取10ml濾液以12滴/s的流速所有通過af-latest-p親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱，取10ml蒸餾水以2滴/s的流速通過親和柱；取10ml蒸餾水以2滴/s的流速再次通過親和柱，直至空氣進(jìn)入到親和柱中。用1.0ml色譜級(jí)的以12滴/s的流速淋洗親和柱，將全部樣品淋洗液(1ml)收集于玻璃測(cè)試管中。取1.0ml 0.003%溴衍生溶液加到測(cè)試管的淋洗液中，混勻。 (4)熒光光度計(jì)測(cè)定將制備好樣液的測(cè)試管置于已標(biāo)定好的熒光計(jì)中。60s后讀數(shù)，測(cè)定結(jié)果

6、為黃曲霉毒素b1+黃曲霉毒素b2黃曲霉毒素g1黃曲霉毒素g2的總量。 4注重事項(xiàng) (1)溴衍生溶液需當(dāng)天配制，當(dāng)天用法，不行重復(fù)用法。 (2)嚴(yán)格操作樣品處理過程。 (3)操作人員需戴口罩和手套舉行樣品處理，避開有毒有機(jī)溶劑毒害。 (4)普通來說，每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目均應(yīng)做平行實(shí)驗(yàn)和空白實(shí)驗(yàn)。平行實(shí)驗(yàn)是采納相同的分析步驟，空白實(shí)驗(yàn)是除不加試樣外，其他步驟同測(cè)定平行實(shí)驗(yàn)。 (二)免疫親和柱凈化一高效液相色譜法 1.檢測(cè)原理 樣品經(jīng)過甲醇-水提取后，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析柱層析凈化，經(jīng)高效液相色譜儀分別，熒光檢測(cè)器柱后光化學(xué)衍生增加后，綜合測(cè)定黃曲霉毒素b1、黃

7、曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2等含量。 2主要試劑及儀器 (1)試劑 甲醇、苯及為色譜純，其試劑為分析純。水(8+2)：取80ml甲酵加20ml水，混合勻稱。甲醇水(45+55)：取45 ml加55 ml水，混合勻稱。苯乙腈(98+2)：取2ml加98 ml苯，混合勻稱。 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：用苯乙腈(98+2)溶液分離配制0.100mg/ml黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于4備用，可用法1年。 黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確移取適量的黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶，50下，氮?dú)獯蹈蓛x吹干

8、，用適量的甲醇水(45+55)溶液定容為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2各分離為0、1、5、10、50ng/ml。 pbs緩沖溶液：稱取8.0g，1.2g，0.2g，0.2g，用990 ml純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)整ph至7.0，最后用純水稀釋至1000 ml。 (2)儀器與設(shè)備高速均質(zhì)器(1800022000r/min )或振蕩器，黃曲霉毒素免疫親和柱(柱容量300ng)，玻璃纖維濾紙(直徑11cm，孔徑1.5um) ,氮吹儀，光化學(xué)衍生系統(tǒng)，高效液相色譜儀(帶熒光檢測(cè)器)。 3檢測(cè)步驟 (1)提取取樣品(粒度小于1mm) 50.0g于250 m

9、l具塞錐形瓶中，加入5.0g及精確加入100.0 ml水(8+2)溶液，以均質(zhì)器高速攪拌提取2min，或振蕩器振蕩30min。定量濾紙過濾，移取10.0ml濾液并加入40.0ml pbs緩沖溶液稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾12次，至濾液澄清，備用。 (2)凈化將免疫親和柱銜接于10.0ml玻璃定量管下。精確移取10.0ml樣品提取液注入玻璃定量管中，將空氣壓力泵與玻璃定量管銜接，調(diào)整壓力使溶液以不超過2ml/min流速緩慢通過免疫親和柱，待溶液所有流出后，以10.0ml純水清洗柱子2次，棄去所有流出液，精確加入1.0ml甲醇洗脫，流速不超過1.0ml/min，收集所有洗脫液于玻璃試管中，加純水定容

10、為2.0ml，供色譜檢測(cè)用。 (3)測(cè)定 色譜條件：色譜柱：c18柱(150mm×4.6 mm id)，流淌相：甲醇水(45+55)溶液，流速：0.8mumin，檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)360nm、放射波長(zhǎng)440nm。 光化學(xué)衍系統(tǒng)：柱溫：30，進(jìn)樣量：20 ul 色譜測(cè)定：分離取相同體積樣液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定試樣的響應(yīng)值(峰高或峰而積)。經(jīng)過與黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖比較響應(yīng)值，得到試樣中黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2的濃度(ug/l)。 (4)結(jié)果計(jì)算樣品中黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2含量，按下式計(jì)算： 式中ai樣品溶液中黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2各組分的峰面積值； vi樣品的總稀釋體積，ml ; pi黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，ng/