微生物菌種選育實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、微生物菌種選育實(shí)驗(yàn)是一門涉及食品理化分析、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)且由學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)課程，集中三周時(shí)間開課。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本環(huán)節(jié)訓(xùn)練，加深對(duì)發(fā)酵工程上游技術(shù)中菌種篩選的認(rèn)識(shí)；學(xué)會(huì)常規(guī)選種方法；掌握微生物誘變育種的方法；掌握常規(guī)工業(yè)微生物菌種保藏法；樹立科學(xué)認(rèn)真仔細(xì)的態(tài)度，培養(yǎng)科研協(xié)作精神。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)一工業(yè)微生物菌種分離根據(jù)一定的生產(chǎn)目的如產(chǎn)酶、產(chǎn)酸、產(chǎn)酯等，建立不同的篩選模型，并從特定的樣品如曲藥、酸乳、土壤中篩選出高產(chǎn)適宜的菌株。1、分離培養(yǎng)基的配制2、無菌器材的準(zhǔn)備3、菌懸液的制備4、接種5、培養(yǎng)6、初步鑒定(1) 菌落形態(tài)(2) 個(gè)體形態(tài)7、斜面接種培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)二工業(yè)微

2、生物菌種復(fù)篩通過搖瓶培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)一所得的菌株的生產(chǎn)性能進(jìn)行精確的定量測(cè)定。1、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制；2、目的菌株的搖瓶培養(yǎng)；3、發(fā)酵液的生理活性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)三 微生物的誘變育種用紫外線對(duì)實(shí)驗(yàn)一所得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行誘變，并測(cè)定誘變后的菌株的生產(chǎn)能力。1、單細(xì)胞(或單孢子 ) 懸液的制備；2、致死曲線的測(cè)定；3、誘變處理；4、初篩；5、復(fù)篩；6、菌種保藏。三、實(shí)驗(yàn)要求1 學(xué)生自行設(shè)計(jì)具體實(shí)驗(yàn)方案，在教師指導(dǎo)下由學(xué)生自主完成實(shí)驗(yàn)。2實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要求學(xué)生完成一篇微型小論文。論文的撰寫應(yīng)本著實(shí)事求是的原則，對(duì)所做實(shí)驗(yàn)過程和數(shù)據(jù)進(jìn)行認(rèn)真、嚴(yán)格的記錄和處理，并進(jìn)行獨(dú)立分析，不得抄襲他人的數(shù)據(jù)。四、考核辦法1、考核內(nèi)容

3、：實(shí)驗(yàn)方案、實(shí)驗(yàn)態(tài)度、操作技能、實(shí)驗(yàn)報(bào)告等。2、考核辦法：按照實(shí)驗(yàn)方案、實(shí)驗(yàn)態(tài)度、操作技能、實(shí)驗(yàn)報(bào)告等內(nèi)容綜合考核學(xué)生，得到學(xué)生該門實(shí)驗(yàn)課程的成績(jī)。成績(jī)考核采用優(yōu)秀、良好、中等、及格、不及格五級(jí)記分制。3、考核標(biāo)準(zhǔn)：以實(shí)際操作技能和分析解決問題的技能為主，實(shí)驗(yàn)考核內(nèi)容各單項(xiàng)所占分?jǐn)?shù)比例為實(shí)驗(yàn)方案20%、實(shí)驗(yàn)態(tài)度10%、操作技能40%、實(shí)驗(yàn)報(bào)告30%。微生物菌種選育概述微生物的菌種對(duì)進(jìn)行微生物工作來講是非常重要的。沒有“種”無法進(jìn)行微生物的 科學(xué)研究；沒有良種，不能進(jìn)行發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)。所以微生物的很多工作都是圍繞著 個(gè)“種”字而進(jìn)行的。菌種選育包括選種和育種兩方面的內(nèi)容。選種是根據(jù)微生物的特性，

4、挑選出符合需要的菌種，一方面可以根據(jù)有關(guān)信息向菌種保藏機(jī)構(gòu)、工廠或科研單位直接索??；另一方面根據(jù)所需菌種的形態(tài)、生理、生態(tài)和工藝特點(diǎn)的要求，采用各種分離篩選方法，從自然界特定的生態(tài)環(huán)境中以特定的方法分離出新菌株。其次是育種的工作，根據(jù)菌種的遺傳特點(diǎn)，在已有的菌種基礎(chǔ)上，采用誘變或雜交等方法，迫使菌種發(fā)生變異，改良菌株的生產(chǎn)性能，使產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量不斷提高。第三當(dāng)菌種的性能下降時(shí)，還要設(shè)法使它復(fù)壯。最后還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合，這樣菌種的優(yōu)良性能才能充分發(fā)揮。第一節(jié) 工業(yè)微生物的分離篩選菌株分離、篩選雖為兩個(gè)環(huán)節(jié)，但卻不能絕然分開，因?yàn)榉蛛x中的一些措施本身就具有篩選作用。工業(yè)微

5、生物產(chǎn)生菌的篩選一般包括兩大部分：一是從自然界分離所需要菌株的分離和篩選一般可分為采樣、富集、分離、產(chǎn)物鑒別幾個(gè)步驟(見圖)一、采樣(一)從土壤中采樣土壤樣品往往是首選的采集目標(biāo)：土壤由于具備了微生物所需的營養(yǎng)、空氣和水分，是微生物最集中的地方；從土壤中幾乎可以分離到任何所需的菌株，空氣、 水中的微生物也都來源于土壤。土壤中微生物分布規(guī)律：一般情況下，土壤中含細(xì)菌數(shù)量最多，且每克土壤的含菌量大體有如下的遞減規(guī)律：細(xì)菌(108)放線菌 (107)霉菌(106)酵母菌(105)藻類(104)原生動(dòng)物(103)，其中放線菌和霉菌指其孢子數(shù)。在分離菌株前要根據(jù)分離篩選的目的，到相應(yīng)的環(huán)境和地區(qū)去采集樣

6、品：因?yàn)楦鞣N微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也隨著地理?xiàng)l件、養(yǎng)分、水分、土質(zhì)、季節(jié)而有很大的變化。1、土壤有機(jī)質(zhì)含量和通氣狀況(1) 耕作土、菜園土和近郊土壤適合于細(xì)菌、放線菌生長(zhǎng)。(2) 山坡上的森林土適合霉菌、酵母菌生長(zhǎng)繁殖。(3) 采土樣最好的土層是5 25cm。2、土壤酸堿度和植被狀況土壤酸堿度會(huì)影響微生物種類的分布。偏堿的土壤(pH7.0 一 7.5)環(huán)境，適合于細(xì)菌、放線菌生長(zhǎng)。反之在偏酸的土壤(pH7.0 以下 )環(huán)境下，霉菌、酵母菌生長(zhǎng)旺盛。3、地理?xiàng)l件4、季節(jié)條件秋季采土樣最為理想。5、采樣方法用取樣鏟，將表層 5cm 左右的浮土除去，取 5 25cm 處的土樣10 2

7、5g， 裝人事先推備好的塑料袋內(nèi)扎好。北方土壤干燥，可在 10 一 30cm 處取樣。 給塑料袋編號(hào)并記錄地點(diǎn)、土壤質(zhì)地、植被名稱、時(shí)間及其他環(huán)境條件。一般樣品取回后應(yīng)馬上分離，以免微生物死亡。但有時(shí)樣品較多，或到外地取樣，路途遙遠(yuǎn)，難以做到及時(shí)分離，則可事先用選擇性培養(yǎng)基做好試管斜面，隨身帶走。到一處將取好的土樣混勻，取3 4g 撤到試管斜面上，這樣可避免菌株因不能及時(shí)分離而死亡。(二)根據(jù)微生物生理特點(diǎn)采樣1、根據(jù)微生物營養(yǎng)類型每種微生物對(duì)碳、氮源的需求不一樣，分布也有差異。微生物的營養(yǎng)需求和代謝類型與其生長(zhǎng)環(huán)境有著很大的相關(guān)性。如森林土有相當(dāng)多枯枝落葉和腐爛的木頭等，富含纖維素，適合利用

8、纖維素作碳源的纖維素酶產(chǎn)生菌生長(zhǎng)；在肉類加工廠附近和飯店排水溝的污水、污泥中， 由于有大量腐肉、豆類、 脂肪類存在，因而，在此處采樣能分離到蛋白酶和脂肪酶的產(chǎn)生菌；在面粉加工廠、糕點(diǎn)廠、酒廠及淀粉加工廠等場(chǎng)所，容易分離到產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶的菌株。若要篩選以糖質(zhì)為原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜餞、甜果及含糖濃度高的植物汁液中采樣。在篩選果膠酶產(chǎn)生菌時(shí)，由于柑橘、草莓及山查等果蔬中合有效多的果膠，因此，從上述樣品的腐爛部分及果園土中采樣較好。若需要篩選代謝合成某種化合物的微生物，從大量使用、生產(chǎn)或處理這種化合物的工廠附近采集樣品，容易得到滿意的結(jié)果。2、根據(jù)微生物的生理特性篩選高溫酶產(chǎn)生菌時(shí)，通常到

9、溫度較高的南方，或溫泉、火山爆發(fā)處及北方的堆肥中采集樣品；分離低溫酶產(chǎn)生菌時(shí)可到寒冷的地方，如南北極地區(qū)、冰窖、 深海中采樣；分離耐壓菌則通常到海洋底部采樣。因?yàn)樯詈Ｖ猩畹奈⑸锬苣秃芨叩撵o水壓，如從海中篩到一株水活微球菌，它能在600 個(gè)大氣壓下生長(zhǎng)。分離耐高滲透壓酵母菌時(shí)，由于其偏愛糖分高、酸性的環(huán)境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜餞或甘蔗渣堆積處采樣。二、富集培養(yǎng)一般情況下，采來的樣品可以直接進(jìn)行分離，但是如果樣品中我們所需要的菌類含量并不很多，而另一些微生物卻大量存在。此時(shí)，為了容易分離到所需要的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，即設(shè)法增加所要菌種的數(shù)量，以增加

10、分離的幾率。可以通過選擇性的配制培養(yǎng)基(如營養(yǎng)成分、添加抑制劑等)， 選擇一定的培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基酸堿度等)來控制。富集培養(yǎng)是在目的微生物含量較少時(shí)，根據(jù)微生物的生理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種選擇性培養(yǎng)基， 創(chuàng)造有利的生長(zhǎng)條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長(zhǎng)繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢(shì)種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)種，以利分離到所需要的菌株。(一)控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分在分離該類菌株之前，可在增殖培養(yǎng)基中人為加入相應(yīng)的底物作惟一碳源或氮源。那些能解利用的菌株因得到充足的營養(yǎng)而迅速繁殖，其他微生物則由于不能分解這些物質(zhì)，生長(zhǎng)受到抑制。(二)控制培養(yǎng)條件在篩選某些微生物時(shí)，除通過培養(yǎng)基營養(yǎng)成分

11、的選擇外，還可通過它們對(duì)pH、 溫度及通氣量等其他一些條件的特殊要求加以控制培養(yǎng)，達(dá)到有效的分離目的。如細(xì)菌、放線菌的生長(zhǎng)繁殖一般要求偏堿(pH7.0 一 7.5)， 霉菌和酵母菌要求偏酸(pH4.5 6.0)。 因此，富集培養(yǎng)基的pH 調(diào)節(jié)到被分離微生物要求范圍不僅有利于自身生長(zhǎng)，也可排除一部分不需要的菌類。分離放線菌時(shí)，可將樣品液在40恒溫預(yù)處理20min，有利于孢子的萌發(fā)，可以較大地增加放線菌數(shù)目，達(dá)到富集的目的。(三)抑制不需要的菌類1、分離細(xì)菌時(shí)，在培養(yǎng)基中加入濃度為50u ml 制霉菌素，可以抑制霉菌和酵母菌的生長(zhǎng)。2、 分離放線菌時(shí)，在樣品中加入0.05十二烷基磺酸鈉(SDS)不

12、僅可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，還能激活放線菌孢子的萌發(fā)。加入氟派酸(5mg/L)+制霉菌素(50 mg/L)+青霉素 (0.8mg/L)也可以有效地抑制細(xì)菌和真菌，而不影響放線菌的生長(zhǎng)。3、分離霉菌和酵母菌時(shí)，在培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素和四環(huán)素各30U ml，可以抑制細(xì)菌和放線菌生長(zhǎng)。4、分離根霉和毛霉時(shí)，由于這些微生物的菌絲易蔓延成片，難以得到純化的菌落，通常在培養(yǎng)基中添加0.1%去氧膽酸鈉或山梨酸防止菌絲蔓延，使菌落長(zhǎng)得小而緊密。三、純種分離經(jīng)富集培養(yǎng)以后的樣品，目的微生物得到增殖，占了優(yōu)勢(shì)，其他種類的微生物在數(shù)量上相對(duì)減少，但并未死亡。富集后的培養(yǎng)液中仍然有多種微生物混雜在一起，即使占了優(yōu)勢(shì)的

13、一類微生物中，也并非純種。(一)稀釋涂布法把土壤樣品以十倍的級(jí)差，用無菌水進(jìn)行稀釋，取一定量的某一稀釋度的懸浮液，涂抹于分離培養(yǎng)基的平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，長(zhǎng)出單個(gè)菌落，挑取需要的菌落移到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。土壤樣品的稀釋程度，要看樣品中的含菌數(shù)多少，一般有機(jī)質(zhì)含量高的菜園土等、樣品中含菌量大，稀釋倍數(shù)高些，反之稀釋倍數(shù)低些。采用該方法，在平板培養(yǎng)基上得到單菌落的機(jī)會(huì)較大，特別適合于分離易蔓延的微生物。(二)劃線分離法用接種環(huán)取部分樣品或菌體，在事先已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基平板上劃線，當(dāng)單個(gè)菌落長(zhǎng)出后， 將菌路移入斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后備用。該分離方法操作簡(jiǎn)便、快捷， 效果較好。(三)利用平皿的生化反應(yīng)進(jìn)行分離

14、這是一類利用特殊的分離培養(yǎng)基對(duì)大量混雜微牛物進(jìn)行初步分離的方法。分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來設(shè)計(jì)的。通過觀察微生物在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況或生化反應(yīng)進(jìn)行分離，可顯著提高菌株分離純化的效率。1、透明圈法在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。能分解底物的微生物便會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)該菌株利用底物的能力。（1） 分離水解酶產(chǎn)生菌該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會(huì)在含有底物的選樣性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈。（2） 分離產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板成混濁狀，將樣

15、品懸浮液涂抹到平板上進(jìn)行培養(yǎng)，由于產(chǎn)酸菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來。2、變色圈法對(duì)于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。3、生長(zhǎng)圈法生長(zhǎng)圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌。工具菌是一些相對(duì)應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍使會(huì)形成一個(gè)混濁的生長(zhǎng)圈。4、抑菌圈法常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選。抑菌圈法是常用的初篩方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，如抗生素

16、等，使會(huì)在該菌落周圍形成工具菌不能生長(zhǎng)的抑菌圈，很容易被鑒別出來。采用該方法已得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。（四）通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件進(jìn)行分離各種微生物對(duì)營養(yǎng)要求和培養(yǎng)條件是不同的，在分離篩選時(shí)，若在這兩個(gè)方面加以調(diào)節(jié)控制，就能獲得更好的分離效果。四、代謝產(chǎn)物鑒別在目的菌株分離的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過篩選，選擇具有目的產(chǎn)物合成能力相對(duì)高的菌株。某些產(chǎn)生菌在分離時(shí)就可結(jié)合篩選，一般在平皿上通過與指示劑、顯色劑或底物等的生化反應(yīng)直接定性分離，這種方法本身就包含篩選內(nèi)容的一部分。但并非所有產(chǎn)生菌都能應(yīng)用平皿定性方法進(jìn)行分離，而是需要經(jīng)過常規(guī)生產(chǎn)性能測(cè)定，即初篩和復(fù)篩方能確定。另外，即使已

17、經(jīng)通過平皿定性反應(yīng)分離的菌株也需要進(jìn)一步篩選和更加精確的定量測(cè)定。（一）初篩初篩是從大量分離到的微生物中將具有合成目的產(chǎn)物的微生物篩選出來的過程。出于菌株多，工作量大，為了提高初篩的效率，通常需要設(shè)計(jì)一種快速、簡(jiǎn)便又較為準(zhǔn)確的篩選方法。初篩要求篩選的菌株盡可能的多，篩選的菌株越多，就約有希望篩選到所需要的菌株。初篩可以分為兩種情況進(jìn)行：1、平板篩選對(duì)那些在純化分離階段沒有采用平皿定性法挑選比來的菌落，即隨機(jī)挑選的菌株，由于數(shù)量很大，又不知是否具有目的產(chǎn)物的生產(chǎn)能力，這時(shí)只能首先采取較粗放的檢測(cè)方法，如平皿快速檢測(cè)法。2、搖瓶發(fā)酵篩選由于搖瓶振蕩培養(yǎng)法更接近于發(fā)酵罐培養(yǎng)的條件，效果比較一致，由此

18、篩選到的菌株易于推廣；因此，經(jīng)過平板定性篩選的菌種可以進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。一般一個(gè)菌株接一個(gè)瓶，在一定轉(zhuǎn)速的搖瓶機(jī)上及適宜的溫度下振蕩培養(yǎng)，得到的發(fā)酵液過濾后按以下方法進(jìn)行活性測(cè)定：先取玻璃板16cm x 26cm或 18cm x 28皿，制備含有鑒定曲（測(cè)定抗生家）或底物 （兩制劑）等的平板。瓊脂板厚約3mm，用內(nèi)徑5mm 鋼圈打孔，取以上過濾后的發(fā)酵液 10ul 逐個(gè)加入，放在鑒定菌或酶作用最適溫度下溫育一定時(shí)間，孔的周圍出現(xiàn)透明的溶菌圈或水解圈。根據(jù)活性圈的大小決定取舍。用該法初步測(cè)定發(fā)酵液的產(chǎn)物活性時(shí)，為避免活性圈較大造成的誤差，可用濾紙片代替。在滅過菌的圓濾紙片上調(diào)入l 一2ul 發(fā)酵液，

19、溫育后測(cè)定?？嗨馊θ赃^大，則可采取稀釋發(fā)酵液或增加底物濃度或瓊脂板厚度的方法，使活性圈的大小有所控制。初篩一株一瓶，取其中10-20%復(fù)篩，一株 3 瓶，直至最后3-5 株，廣泛考察。（二）復(fù)篩瓊脂平板活性測(cè)定法，其最大的優(yōu)點(diǎn)就是簡(jiǎn)便、快速，因而在篩選工作量大時(shí)具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)越件。該法的不足之處是產(chǎn)物活性只能相對(duì)比較，難以得到確切的產(chǎn)量水平，只適用于初篩。通過該法可淘汰85一90不符合要求的微生物，剩下較好的菌株則需進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩；這時(shí)一個(gè)菌株通常要重復(fù)3 5 個(gè)瓶，培養(yǎng)后的發(fā)酵液采用精確分析方法測(cè)定。具體做法：把所有搖瓶復(fù)篩菌株的發(fā)酵液，用瓊脂平板法測(cè)定一遍（同步重復(fù)2 3 塊板），將其中

20、活性圈大而清晰的菌株發(fā)酵液進(jìn)一步采用精確檢測(cè)法測(cè)定，選出較優(yōu)良的菌株2 3 株。這種直接從自然界樣品中分離出來具有一定生產(chǎn)性能的菌株，稱為野生型菌株。第二節(jié) 誘變育種工業(yè)微生物育種過程分為三個(gè)階段：菌種基因型改變；篩選菌種，確認(rèn)并分離出具有目的基因型或表型的變異株；產(chǎn)量評(píng)估，全面考察此變異株在工業(yè)化生產(chǎn)上的接受性。簡(jiǎn)言之，工業(yè)微生物育種就是經(jīng)由改變和操縱微生物的基因，進(jìn)而選育出適合工業(yè)化生產(chǎn)的菌種的一種綜合技術(shù)。從自然界直接分離的菌種，一般而言其發(fā)酵活力往往是比較低的，不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此要根據(jù)菌種的形態(tài)、生理上的特點(diǎn)，改良菌種。一、誘變育種的作用1、提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量2、改善菌種特性

21、、提高產(chǎn)品質(zhì)量3、簡(jiǎn)化工藝條件4、開發(fā)新品種二、誘變育種的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備工作誘變育種工作包括誘發(fā)突變、突變株的篩選和高產(chǎn)變株最佳環(huán)境條件的調(diào)整。誘發(fā)突變包括出發(fā)菌株、誘變劑及其劑量的選擇、影響誘變效果的因素。突變株的篩選包括篩選條件（培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件）及選擇一個(gè)簡(jiǎn)便、快速、有效的篩選方法。環(huán)境條件調(diào)整是突變株的最佳培養(yǎng)條件改變。以上是決定誘變育種成敗的三個(gè)方面，在育種開展之前，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康木o緊圍繞三個(gè)環(huán)節(jié)制訂試驗(yàn)方案。（一）了解影響菌種生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素主要影響有如下幾個(gè)方面：1、培養(yǎng)基2、培養(yǎng)基斜面制備技術(shù)3、移種的密度4、溫度5、濕度（二）了解菌株的菌落形態(tài)霉菌、放線菌的菌落形態(tài)特征包括：

22、菌落大小、形狀、高度、放射線多少、外觀組織結(jié)構(gòu)（粉狀、絨毛狀、絮狀等）、孢子多少和色澤、可溶性色素情況等。細(xì)菌菌落形態(tài)特征包括：菌落大小、形狀、邊緣結(jié)構(gòu)、高度、顏色、光澤、黏性、表面結(jié)構(gòu)、可溶性色素等。（三）了解菌種特性及其與生產(chǎn)性能的關(guān)系1、多方面考查菌種的生活史，了解它們的形態(tài)、生理、生化等生物學(xué)特性，以及這些特性與代謝產(chǎn)物合成的關(guān)系。2、研究菌種的某些生物學(xué)特性與產(chǎn)量合成相關(guān)性。3、了解菌種的最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件（包括斜面培養(yǎng)基及一、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基）。（四）建立一個(gè)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)產(chǎn)物的方法由于誘發(fā)突變頻率極低，需要從相當(dāng)數(shù)量的誘變分離菌株中篩選，才有可能移得較理想的突變株。限制篩選

23、量的主要因素，除了搖瓶量之外，檢測(cè)方法也是重要因素，所以建立一個(gè)適應(yīng)于大規(guī)模篩選的有效的檢測(cè)方法是十分必要的。（五）研究最佳的菌種保藏培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件一個(gè)優(yōu)良菌種的獲得往往要花費(fèi)巨大的人力、物力和時(shí)間，是非常不容易的，不能隨便采用某個(gè)培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和保藏方法進(jìn)行培養(yǎng)和保藏。否則， 容易發(fā)生回復(fù)突變，使菌種特性衰退，優(yōu)良特性消失，結(jié)果將前功盡棄。因此， 事先研究一個(gè)最佳的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和適宜的保藏方法是相當(dāng)重要的。三、誘變育種的步驟與方法基本步驟：原種 （出發(fā)菌株） 純化 斜面 同步培養(yǎng) 離心洗滌振蕩打散過濾 菌懸液 誘變處理 平板分離 斜面 斜面 斜面 保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)（活菌計(jì)數(shù)）（計(jì)數(shù)）（

24、變異率）（初篩）（復(fù)篩）（再復(fù)篩）（一）出發(fā)菌株的選擇用來進(jìn)行誘變或基因重組育種處理的起始菌株稱為出發(fā)菌株。在誘變育種中，出發(fā)菌株的選擇，會(huì)直接影響到最后的誘變效果，因此必須對(duì)出發(fā)菌株的產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方面有相當(dāng)?shù)牧私猓暨x出對(duì)誘變劑敏感性大、變異幅度廣、產(chǎn)量高的出發(fā)菌株。1、對(duì)出發(fā)菌株的要求生長(zhǎng)快，營養(yǎng)要求粗放，發(fā)育早，產(chǎn)孢子多，對(duì)誘變劑敏感性高，已能積累少量產(chǎn)品或前體物的菌株。2、出發(fā)菌株的選擇（3） 選取自然界新分離的野生型菌株，它們對(duì)誘變因素敏感，容易發(fā)生變異；（4） 選取生產(chǎn)中由于自發(fā)突變或長(zhǎng)期在生產(chǎn)條件下馴化而篩選得到的菌株，與野生型菌株較相象，容易達(dá)到較好的誘變效果；（5） 選

25、取每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變可能效果迭加，積累更多的提高。另外，出發(fā)菌株還可以同時(shí)選取23 株，在處理比較后，將更適合的菌株留著繼續(xù)誘變。（二）出發(fā)菌株的純化1、目的：獲得遺傳性狀基本一致的，并且穩(wěn)定的變種。2、原因：遺傳背景復(fù)雜的菌種誘變后負(fù)變率將增加；誘變史長(zhǎng)的菌株，采用強(qiáng)烈誘變劑處理，又不進(jìn)行純化分離，誘變效果差的。3、純種分離方法：常用劃線分離法和稀釋分離法。（三）同步培養(yǎng)（前培養(yǎng)）1、目的：獲得生理狀態(tài)一致的培養(yǎng)物。在誘變育種中，處理材料一般采用生理狀態(tài)一致的單倍體、單核細(xì)胞，即菌懸液的細(xì)胞應(yīng)盡可能達(dá)到同步生長(zhǎng)狀態(tài)，這稱為同步培養(yǎng)。2、原因：突變率高，重現(xiàn)性也好。3

26、、方法：（6） 細(xì)菌一般要求培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；（7） 霉菌處理使用分生孢子，應(yīng)該將分生孢子在液體培養(yǎng)基中短時(shí)間培養(yǎng)，使孢子孵化，處于活化狀態(tài)，并恰好未形成菌絲體。（四）單細(xì)胞（或單孢子）懸液的制備1、目的獲得單細(xì)胞（或單孢子） 、均勻的懸液。2、原因在誘變育種中，所處理的細(xì)胞必須是單細(xì)胞、均勻的懸液狀態(tài)。這是因?yàn)椋环矫娣稚顟B(tài)的細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑，還可減少分離現(xiàn)象發(fā)生。另一方面又可避免長(zhǎng)出不純菌落。3、方法(1) 菌齡：對(duì)數(shù)期細(xì)胞、剛成熟的孢子或活化的孢子(2) 菌懸液濃度：一般真菌孢子或酵母菌細(xì)胞懸浮液的濃度為106個(gè) /mL、 放線菌或細(xì)菌的濃度為108 個(gè) mL 左右。菌懸液的孢

27、子或細(xì)菌數(shù)可用平板計(jì)數(shù)、血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)和光密度計(jì)數(shù)。(3) 菌懸液的配制方法：離心洗滌前培養(yǎng)物，用冷生理鹽水或緩沖液制備菌懸液，放在盛有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)振蕩 10min，令其分散，用無菌脫脂棉或?yàn)V紙過濾。通過菌體計(jì)數(shù)，調(diào)整菌懸液的濃度供誘變處理。(五)誘變處理1、誘變劑種類的選擇常用誘變劑有兩大類：物理誘變劑和化學(xué)誘變劑。常用的物理誘變劑有紫外線、x射線、 射線(如Co60 等 )、等離子、快中子、 射線、 射線、超聲波等。常用的化學(xué)誘變劑有堿基類似物、烷化劑、羥胺、吖定類化合物等。物理誘變劑中最常用的有紫外線。(1) 根據(jù)誘變劑對(duì)基因作用的特異性選擇(2) 根據(jù)菌種特性和遺傳穩(wěn)定性來選擇誘變

28、劑(3) 參考出發(fā)菌株原有的誘變系譜來選擇誘變劑2、最適誘變劑量的選擇(1) 誘變劑劑量的表示方式各種誘變劑有不同的劑量表示方式：1) UV 的劑量指強(qiáng)度與作用時(shí)間的乘積。2) 化學(xué)誘變劑常以在一定外界條件下誘變劑的濃度和作用時(shí)間的乘積來表示。3) 在育種實(shí)踐中，常以殺菌率來作誘變劑的相對(duì)劑量。(2) 最適誘變劑量的確定1) 確定依據(jù)誘變的最適劑量，應(yīng)該使所希望得到的突變株在存活群體中占有最大的比例。2) 確定方法通過比較劑量存活率曲線和劑量誘變率曲線，找到某誘變劑的劑量存活率誘變率三者的最佳結(jié)合點(diǎn)，即為誘變劑的最適劑量。 劑量存活率曲線以誘變劑的劑量為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞存活率的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制

29、的曲線。 劑量誘變率曲線以誘變劑的劑量為橫坐標(biāo)，以誘變后獲得的突變細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制的曲線。一般以誘變后微生物的致死率在90%99.9% 的劑量為最佳劑量，近來也有傾向于采用殺菌率70%75%甚至更低(30%70%)的劑量。一般認(rèn)為，偏低的劑量處理后正突變率較高，而用較高的劑量時(shí)則負(fù)突變率較高，但高劑量造成損傷大、回復(fù)少。目前趨向采用低劑量、長(zhǎng)時(shí)間處理，盡管致死率較高，而誘變效果較好。3) 紫外誘變的方法 將 10mL 菌懸液放在直徑為9cm 的培養(yǎng)皿中，液層厚度約為2mm，啟動(dòng)磁力攪拌器，使用15w 功率紫外燈管，照射距離為30cm 左右，照射時(shí)間以幾秒至數(shù)十分鐘為宜，具芽孢的菌株需處理10

30、min 左右。為準(zhǔn)確起見，照射前紫外燈應(yīng)先預(yù)熱2030min，然后再進(jìn)行處理。不同的微生物對(duì)于紫外線的敏感程度不一樣，因此不同的微生物對(duì)于誘變所需要的劑量也不同。 設(shè)計(jì)一個(gè)照射不同時(shí)間梯度的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)不同時(shí)間照射的死亡率，作出照射時(shí)間與死亡率的曲線，這樣就可以選擇適當(dāng)?shù)恼丈鋭┝?。在紫外燈的功率、照射距離已定的情況下，決定照射劑量的只有照射時(shí)間，這樣可以設(shè)計(jì)一個(gè)照射不同時(shí)間梯度的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)不同時(shí)間照射的死亡率，作出照射時(shí)間與死亡率的曲線，這樣就可以選擇適當(dāng)?shù)恼丈鋭┝俊?實(shí)驗(yàn)中避免光復(fù)活現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了避免光復(fù)活現(xiàn)象，處理過程應(yīng)在暗室的紅光下操作，處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用黑布包起來培養(yǎng)，然

31、后再進(jìn)行分離篩選。3、誘變劑的處理方式誘變劑的處理方式，可分為單因子處理和復(fù)合因子處理。(1) 單因子處理采用單一誘變劑處理出發(fā)菌株。(2) 復(fù)合因子處理指兩種以上誘變因子共同誘發(fā)菌體突變。(六)后培養(yǎng)對(duì)于剛經(jīng)誘變劑處理過的菌株，有一個(gè)表現(xiàn)遲滯的過程，即細(xì)胞內(nèi)原酶有量的稀釋過程(生理延遲)，需 3 代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。據(jù)此應(yīng)讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時(shí)，使細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，穩(wěn)定的變異就會(huì)顯現(xiàn)出來。若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會(huì)出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時(shí)存在于一個(gè)菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定

32、和將來的菌株退化。(七)突變株的分離與篩選突變是隨機(jī)不定向的，但是篩選是定向的。篩選的條件決定選育的方向，因?yàn)橥蛔凅w高產(chǎn)性能總是在一定的培養(yǎng)條件下才能表現(xiàn)出來。在一個(gè)適于突變株繁殖的特定條件下可以篩選到具有新性狀的菌株，其他原養(yǎng)型菌株則逐步被淘汰。所以，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是決定菌種某些持性保留或淘汰的“篩子”。為了有效地選出突變株，必須采用使新個(gè)體表型得以充分表達(dá)的篩選條件。1、篩選方案：在實(shí)際工作中，一般認(rèn)為應(yīng)采用把篩選過程分為初篩與復(fù)篩兩個(gè)階段的篩選方案為好。前者以量(選留菌株的數(shù)量)為主，后者以質(zhì)(測(cè)定數(shù)據(jù)的精確度)為主。2、篩選方法(1) 隨機(jī)篩選也稱搖瓶篩選。該法主要是隨機(jī)挑選的平板菌

33、落進(jìn)行搖瓶篩選。具體做法是：將誘變處理后的菌體分離在瓊脂平板上，培養(yǎng)后隨機(jī)挑選菌落，一個(gè)菌落移入一支斜面，然后一個(gè)斜面的菌體接入只錐形三角瓶、放置在搖瓶機(jī)上振蕩培養(yǎng)，根據(jù)測(cè)定產(chǎn)物活性的高低，決定取舍。這種篩選法的優(yōu)點(diǎn)是：不管種子或發(fā)酵過程的生產(chǎn)條件、生理?xiàng)l件如何， 都與發(fā)酵罐大生產(chǎn)條件相近，可以模擬進(jìn)行。搖瓶中的通氣量可以通過調(diào)整轉(zhuǎn)速、裝量和瓶?jī)?nèi)加檔板等方法加以控制。在突變概率小的情況下，如果菌落挑取少了，很難篩選到理想的突變株。根據(jù)瑟芝帝工作法，高產(chǎn)菌株概率愈低篩選菌落數(shù)量就越大，如果突變頻率為1、那么初篩挑選菌落起碼要200 個(gè)。(2) 平板菌落預(yù)篩平板菌落篩選，是在培養(yǎng)皿或特制玻璃框平板

34、上進(jìn)行的，是用于誘變后從試樣小檢出突變體的一種瓊脂平板篩選法。實(shí)際上是搖瓶初篩前的一種預(yù)篩，應(yīng)該說是初篩的部分。通過預(yù)篩可以淘汰那些低產(chǎn)菌株。平板篩選技術(shù)種類很多，有的是根據(jù)菌落形態(tài)淘汰低產(chǎn)菌株，有的則利用每個(gè)菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基中檢定菌、底物或指示性物質(zhì)作用后，在其周圍形成抑菌圈、呈色圈或其他特異性反應(yīng)圈，通過測(cè)量反應(yīng)圈白徑與菌落直徑之比值，來衡量突變株的產(chǎn)量高低。常用的方法有紙片培養(yǎng)顯色法、透明圈法、瓊脂塊培養(yǎng)法等。3、搖瓶液體培養(yǎng)常規(guī)隨機(jī)篩選的全過程，都要通過搖瓶培養(yǎng)，而平板菌落篩選是經(jīng)過平板菌落預(yù)篩后，棄去大量低產(chǎn)菌株，被挑選的菌落移入試管斜面，然后再進(jìn)行搖瓶液體培養(yǎng)，才能逐步地篩選出高產(chǎn)菌株。4、產(chǎn)物活性別定活性測(cè)定是菌種篩選工作的重要組成部分，也是決定篩選效率的主要因素。根據(jù)一般突變規(guī)律，一個(gè)出發(fā)菌株通過一次誘發(fā)突變，生產(chǎn)能力提高5的變株約1 50，而生產(chǎn)能力提高10以上的變株僅在1/300左右。由此可見，初篩的菌株越多，優(yōu)良菌株漏篩的概率越少。擴(kuò)大篩選量，是提高育種效率很重要的一個(gè)方面。通常誘變一代至少要挑選 1000 株以上，經(jīng)平皿預(yù)篩后