鼠抗人cKit單克隆抗體的制備及其特性鑒定

1、鼠抗人cKit單克隆抗體的制備及其特性鑒定 作者：劉虹辰, 毛朝明, 蘇曉瑜, 阮錚, 丁秋蘭, 王學(xué)鋒, 王鴻利, 奚曉東【摘要】 目的: 鼠抗人cKit單克隆抗體（mAb）的研制及其生物學(xué)特性的鑒定。方法: 利用PCR技術(shù)獲得人cKit的胞外免疫球蛋白區(qū)編碼序列, 并將其亞克隆至原核表達載體pQE30, 構(gòu)建出重組表達質(zhì)粒pQE30hKitD45。測序鑒定正確后轉(zhuǎn)化M15, 經(jīng)IPTG37誘導(dǎo)4 h后, SDSPAGE顯示融合蛋白（表達產(chǎn)物）以包涵體形式存在。用鎳柱對融合蛋白進行純化, 將純化的蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)進行細胞融合, 經(jīng)流式細胞術(shù)（FCM）分析和

2、多次克隆化培養(yǎng), 篩選出特異分泌鼠抗人cKit分子mAb的雜交瘤細胞株。采用Western blot、 Ig亞型快速定性試紙法、 FCM等對mAb的生物學(xué)特性進行鑒定。結(jié)果: 成功表達及純化了人cKit重組蛋白, 并獲得1株持續(xù)、 穩(wěn)定分泌鼠抗人cKit mAb的雜交瘤細胞株, 命名為SRJ1。ELISA和Western blot、 FCM結(jié)果顯示了該株mAb 能夠識別Kasumi白血病細胞株表面表達的天然的cKit分子, 并與人正常外周血細胞無交叉反應(yīng)。值得注意的是, Kasumi細胞含有一個不被SRJ1識別的亞群, 雖然其表達cKit（Ab81 mAb的結(jié)合正常）。結(jié)論: 成功構(gòu)建了原核表

3、達載體pQE30Kit45, 并獲得高純度的人pQE30Kit45重組蛋白; 成功制備了1株特異性的鼠抗人cKit mAb雜交瘤。其所分泌的抗體能特異地識別人cKit分子, 并且可能成為區(qū)分細胞表面表達不同cKit分子的潛在檢測工具。 【關(guān)鍵詞】 cKit; 原核重組蛋白; 雜交瘤; 單克隆抗體; 白血病 Abstract AIM: To prepare anticKit monoclonal antibodies and characterize their specificity of epitope recognition. METHODS: cDNA encoding human cK

4、it extracellular domain was constructed into a procaryotic expression vector pQE30 and the correctness of the reconstructed plasmid pQE30KitD45 was verified by sequencing. The plasmid was transformed into E.coli M15 strain. Recombinant 6His pQE30KitD45 was expressed after induction by IPTG for 4 h.

5、Then SDSPAGE results suggested that the products mainly formed inclusion bodies. The fusion protein was further purified with NiNTAHis affinity chromatography and then used to immunize BALB/c mice. The hybridomas were achieved by fusing the immunized spleen cells with the Sp2/0 myeloma cell line. Th

6、e positive clones were screened by FCM with CHOhKit cells. Hybidoma clones secreting anticKit antibodies were further subcloned and investigated for their biological activities by Western blot, rapid isotyping analysis and FCM. RESULTS: Recombinant human cKit fusion proteins were in vitro expressed

7、and purified to be used as immunogen. One stable hybridoma cell line, which continuously secrets specific anticKit monoclonal antibody (SRJ1) was established. The biological activity studies showed that the monoclonal antibody recognized the natural cKit expressed on the Kasumi leukemia cell line, b

8、ut failed to bind to the normal human peripheral blood cells. Interestingly, this monoclonal antibody failed to recognize a subpopulation of Kasumi cells that is reactive with the commercial anticKit mAb Ab81 suggesting that the cKit expressed by this subpopulation contains some sequencial and/or st

9、ructural aberrations that are distinguishable by mAb SRJ1. CONCLUSION: With an immunization procedure using purified recombinant human cKit fusion proteins. a hybridoma cell line continuously and stably secreting anticKit monoclonal antibody has been established. The monoclonal antibody SRJ1 specifi

10、cally recognizes human cKit expressed on the leukemia cells, and may provide a novel approach to analyze the possible structural variations of cKit expressed by different cells. KeywordscKit; procaryotic fusion proteins; hybridoma; monoclonal antibody; leukemia自cKit受體被發(fā)現(xiàn)以來, 其與干細胞因子（SCF）就作為一組重要的受體配基復(fù)

11、合物通過激活下游信號通路, 產(chǎn)生強大的連鎖反應(yīng), 從而在細胞的分化增殖等調(diào)控中發(fā)揮著舉足輕重的作用。迄今為止, 二聚化結(jié)構(gòu)及十幾條激酶介導(dǎo)的信號通路被陸續(xù)證實與cKit的持續(xù)活化密切相關(guān)。而針對這一異?；罨O(shè)計的靶向藥物也陸續(xù)投入應(yīng)用, 這都成為目前人類相關(guān)腫瘤如急性髓性白血?。ˋML）、 胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）等研究的熱點1-3。但世界范圍內(nèi)cKit相關(guān)抗體類藥物的應(yīng)用尚處于萌芽狀態(tài), 激酶抑制劑類藥物的廣泛應(yīng)用卻已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多不良反應(yīng)。故本實驗中我們通過工程菌表達并且純化了cKit的部分蛋白片段, 將其免疫小鼠獲得了特異性的單克隆抗體（mAb）, 為進一步探討該蛋白的生物學(xué)功能提供了有利

12、的手段。 1 材料和方法 1.1 材料 IPTG、 dNTP、 Taq DNA聚合酶, ECL試劑購自上海生工公司, pGEMT載體及T4連接酶購自Promega公司, 限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司, 割膠回收試劑盒購自Axygen公司, DNA marker購自天根生物公司, F12、 RPMI1640、 次黃嘌呤胸腺嘧啶核苷（HT）和氨基喋呤次黃嘌呤胸腺核苷（HAT）均購自Gibco公司, 胎牛血清購自JRH公司, 聚乙二醇、 弗氏完全及不完全佐劑購自Sigma公司, 抗cKit mAb(Ab81)購自Santa Cruz Biotechnology, antihis mAb為本所保存

13、, 羊抗小鼠IgGHRP購自Calbiochem公司, NiNTA柱及純化試劑盒購自Qiagen公司。原核表達載體pQE30、 感受態(tài)細菌E.coli DH5和E.coli M15由本室保存; hpGEMTKit由本所克隆并保存。小鼠骨髓瘤細胞（Sp2/0）、 倉鼠卵巢細胞（CHO）及穩(wěn)定表達cKit的CHOhKit細胞株(用1 800 bp的cKit序列構(gòu)建的真核表達載體轉(zhuǎn)染的CHO細胞)為本室所建立并傳代保存; 免疫用BALB/c小鼠來自本校醫(yī)學(xué)院動物中心。 1.2 方法1 2 結(jié)果 2.1 pQE30hKitD45重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以hpGEMTKit質(zhì)粒為模板, PCR擴增獲得

14、hcKit胞外編碼區(qū)產(chǎn)物cKitD45, 全長為686 bp, 與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。直接將純化的PCR產(chǎn)物與T載體連接, 菌落經(jīng)藍白斑初步鑒定后, 提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA, 分別用BamH I和Hind III酶切pQE30及pGEMTKitD45質(zhì)粒, 將片段與雙酶切后的pQE30載體相連。并再次酶切鑒定重組質(zhì)粒pQE30hKitD45, 目的片段大小與預(yù)期相符（圖2）。測序結(jié)果顯示目的序列與NCBI（Accession Number : NM_000222）相應(yīng)的序列相符, 證實表達載體構(gòu)建成功。 2.2 pQE30hKitD45融合蛋白的誘導(dǎo)表達及Western blot鑒定 pQ

15、E30hKitD45陽性菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDSPAGE顯示: 在37、 1M IPTG誘導(dǎo)4 h的條件下, 融合蛋白的表達達到高峰, 蛋白條帶位于696 bp處（與預(yù)期相符）。該重組蛋白主要以包涵體形式存在, 用NiNTA柱進行純化后, 蛋白純度掃描證實蛋白純度在90%以上, Bradford法測定純化后的hcKitD45蛋白濃度為300 mg/L（圖3）。 2.3 mAb的制備與鑒定 3 討論 cKit在配子形成、 造血、 肥大細胞發(fā)育及功能、 黑色素生成等方面均發(fā)揮著重要的作用。因此, c圖6 飽和濃度mAb SRJ1對CHOhKit細胞及白血病細胞株Kasumi的FCM檢測Kit表達

16、產(chǎn)物的完全缺失所致的功能喪失及堿基序列突變導(dǎo)致的功能性激活（包括點突變, 缺失突變, 錯義突變, 插入突變等）與人類某些腫瘤（如AML、 GIST、 黑色素瘤等）的發(fā)生密切相關(guān)。近幾年發(fā)現(xiàn)一系列致病相關(guān)性突變, 例: JMD區(qū)中FC522突變可引起受體自發(fā)磷酸化而激活, 從而導(dǎo)致非配基依賴性地信號傳導(dǎo)的發(fā)生。而此類病例對于酪氨酸激酶抑制劑Imatinib的應(yīng)用極為敏感4; NK822突變主要與AML/ETO所介導(dǎo)的白血病相關(guān), 應(yīng)用Imatinib可以有效抑制下游信號傳遞, 從而抑制惡性細胞的分裂增殖5; DV816突變主要發(fā)生于系統(tǒng)性全身肥大細胞增多癥及肥大細胞性白血病, 其主要增強了表達c

17、kit受體細胞的遷徙能力, 并且在SCF含量豐富的組織中促進了肥大細胞的過度增生6。但也發(fā)現(xiàn)這種類型的突變能夠造成Imatinib耐藥病例的產(chǎn)生。針對Imatinib應(yīng)用的局限性, 研究開發(fā)各種新型的激酶抑制劑亦成為另一熱點。目前, PKC421、 AP23464、 Dasatinib等正嘗試被應(yīng)用于Imatinib耐藥病例的。但是, 激酶類藥物的應(yīng)用本身就存在某些嚴(yán)重的副作用, 例如: 藥物對于野生型cKit活性的抑制, 從而干擾正常細胞的分化增殖; 藥物對其它結(jié)構(gòu)或功能類似的激酶作用不同程度的抑制, 從而阻斷重要的體內(nèi)正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 影響細胞正常功能; 另還有研究表明, 藥物的應(yīng)用大大

18、增加了誘發(fā)受體二次突變的機率。因此, 如何從根本上尋找到一種合理有效的抑制劑類藥物對于cKit相關(guān)疾病的診治將具有十分重要的意義。而最新的研究結(jié)果表明, cKit胞外免疫球蛋白第四、 五區(qū)的某些氨基酸殘基, 例如: 精氨酸381, 谷氨酸386等, 對于二聚化過程中受體單體間的偶聯(lián)起著關(guān)鍵性的作用7。這無疑為未來針對cKit受體相關(guān)腫瘤的治療藥物及方法的開發(fā)提供極為有效的新基點。 Kasumi是經(jīng)典的t(8; 21)/M2細胞系。研究表明, Kasumi細胞表面所表達的cKit存在Asn822Lys位的突變, 且突變的cKit的數(shù)量約為正常cKit表達量的5倍。Asn822在RTK家族的激活環(huán)中高度保守, 能引起非配體依賴的cKit受體的激活, 使Kasumi細胞系成為體外研究具有cKit突變的AML的理想模型。 本研究中我們成功表達了重組人cKit, 制備了高特異性、 高效價的抗人cKit mAb, 同時表達的重組蛋白具有較高的純度和較強的免疫原性; 同時, FCM針對白血病細胞株Kasumi的結(jié)果也提示其可能可以作為區(qū)