鎳與多基因致癌作用

1、鎳與多基因致癌作用         鎳是人類生產(chǎn)、生活中的重要金屬和人體必需微量元素，同時也是一種多系統(tǒng)、多器官、多細(xì)胞毒物。鎳化合物已被確認(rèn)為人類確證致癌物。許多報道認(rèn)為：鎳進(jìn)入細(xì)胞后主要通過自由基作用、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)及堿基甲基化等遺傳、非遺傳方式致癌1-5。我們就鎳致癌過程中的多基因變異研究進(jìn)行回顧，為鎳的分子致癌機(jī)制研究提供參考。 一、鎳與原癌基因的激活 就其本質(zhì)而言，原癌基因是一類編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的正常細(xì)胞基因，對細(xì)胞的正常生長有極其重要的作用。當(dāng)其發(fā)生突變或異常表達(dá)時，就成為導(dǎo)致細(xì)胞惡變的癌基因6。

2、在鎳的致癌機(jī)制中，研究最多的是c-myc、c-ras、c-jun、c-fos癌基因和NFB蛋白基因。 1.myc基因：myc基因表達(dá)DNA結(jié)合蛋白，分布于核內(nèi)，參與RNA的加工、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及細(xì)胞分化。正常細(xì)胞中通常myc只在細(xì)胞分裂早期增加，而在許多癌細(xì)胞中均見到其異常表達(dá)。Sunderman等7在雄性Fisher-344大鼠單側(cè)腎臟注射20 mg Ni3S2后，觀察到腎癌及多種肉瘤，腫瘤細(xì)胞中染色體畸變多見，DNA斑點(diǎn)雜交和圖像分析表明：N-myc基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，超出正常細(xì)胞6倍。說明Ni3S2明顯誘導(dǎo)myc原癌基因的擴(kuò)增。 2.ras癌基因：ras癌基因由4個外顯子組成，編碼p21蛋白

3、，它定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，其功能與G蛋白類似，是細(xì)胞內(nèi)重要的信息傳導(dǎo)分子。多數(shù)癌細(xì)胞ras通道被不正常激活。Haugen8及Kawanishi等9先后發(fā)現(xiàn)鎳致癌與ras癌基因有關(guān)。Kathleen等10用硫化鎳和硫化亞鎳誘發(fā)大鼠腎肉瘤后，用PCR方法在腎肉瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)k-ras基因的第12密碼子存在GGTGTT的顛換，而其他密碼子未發(fā)現(xiàn)突變現(xiàn)象。說明ras基因的第12密碼子是鎳的選擇性攻擊位點(diǎn)，ras原癌基因由于點(diǎn)突變而激活。此外，還發(fā)現(xiàn)ras基因被不正常激活后，腫瘤發(fā)生的潛伏期縮短，這與ras表達(dá)蛋白的功能有關(guān)。因?yàn)閜21蛋白是調(diào)控細(xì)胞生長的重要分子，ras過度表達(dá)，細(xì)胞生長加速，故潛伏期變短。

4、 3.AP-1(fos/jun)癌基因：c-fos和c-jun癌基因表達(dá)產(chǎn)物為核轉(zhuǎn)錄因子，是信息通路的核內(nèi)部分。DNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)均與之有關(guān)。AP-1癌基因是c-fos和c-jun癌基因的雜合二聚體復(fù)合物，也具有上述性質(zhì)11，許多腫瘤與之激活有關(guān)。Konstantin等12發(fā)現(xiàn)鎳誘導(dǎo)c-fos和c-jun基因的表達(dá)。他們用氯化鎳持續(xù)染毒BALB/c3T3細(xì)胞，結(jié)果該細(xì)胞株獲得了對濃度高達(dá)200 mol/L鎳的抵抗力(故稱B200細(xì)胞)。作者研究了鎳對B200細(xì)胞和野生型3T3細(xì)胞AP-1的DNA結(jié)合活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型3T3細(xì)胞AP-1的DNA結(jié)合力比B200細(xì)胞強(qiáng)。由于AP-1基因是

5、c-fos和c-jun的二聚體，故作者隨后用Northern blot法分析了c-fos和c-jun的表達(dá)，取得了與上述一致的結(jié)果。c-jun和c-fos在野生型3T3細(xì)胞中表達(dá)要強(qiáng)，而B200細(xì)胞表達(dá)很低。說明鎳能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子AP-1(jun/fos)的表達(dá)。 4.NFB蛋白基因：NFB蛋白是結(jié)合于增強(qiáng)子的調(diào)控蛋白，參與多種細(xì)胞因子的活化。鎳能誘導(dǎo)該調(diào)控蛋白的表達(dá)。Konstantin等12在比較B200細(xì)胞和野生型3T3細(xì)胞對鎳的不同反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鎳對NFB蛋白有誘導(dǎo)作用。 二、鎳與抑癌基因的失活 抑癌基因與癌基因是一對矛盾的統(tǒng)一體，控制著細(xì)胞的生長和分化。在正常細(xì)胞中，抑癌基因通常處于

6、一定程度的表達(dá)；而在腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因經(jīng)常丟失或失活。鎳的致癌過程與Rb和p53等多種抑癌基因的失活密切相關(guān)。 2.Rb基因：Rb基因最早在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的患者中發(fā)現(xiàn)缺失，隨后發(fā)現(xiàn)它有重要的抑癌功能。鎳的致癌作用也與Rb基因的變化有關(guān)。Lin等16用晶體硫化鎳處理人成骨細(xì)胞(HOS)，使HOS細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。他們發(fā)現(xiàn)：惡變細(xì)胞中Rb蛋白(pRb)不能進(jìn)行磷酸化，不能與SV40大T抗原形成復(fù)合物，而只能次磷酸化；當(dāng)通過Rb表達(dá)載體將正常Rb基因轉(zhuǎn)入鎳轉(zhuǎn)化的HOS細(xì)胞后，該細(xì)胞又具有正常表型，呈現(xiàn)接觸抑制，且表達(dá)的pRb能被磷酸化。說明鎳轉(zhuǎn)化細(xì)胞中Rb基因失活了。 3.衰老基因：Catheri

7、ne等17發(fā)現(xiàn)鎳轉(zhuǎn)化的中國倉鼠細(xì)胞X染色體長臂(xq)發(fā)生完全丟失，細(xì)胞獲得不死性，并可在裸鼠身上致瘤。將正常細(xì)胞的X染色體經(jīng)微細(xì)胞融合技術(shù)轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，這些細(xì)胞出現(xiàn)死亡。由于X染色體上存在多個衰老基因，推測是鎳引起X染色體上衰老基因的失活。Deborah等18則在鎳轉(zhuǎn)化的敘利亞倉鼠皮膚細(xì)胞(SHD)里發(fā)現(xiàn)衰老基因的失活，觀察到是X染色體上的亞顯微間隙基因缺失(sub-microscopic interstitial genetic deletion)所致。        4.血小板反應(yīng)蛋白(thrombospo

8、ndin)基因：血小板反應(yīng)蛋白是一種可接受促分裂原的鈣結(jié)合蛋白，對血栓塊有穩(wěn)定作用。它在腫瘤發(fā)生學(xué)上的意義在于能夠阻止腫瘤，具有抑制作用，故被認(rèn)為也是抑癌基因19。Salnikow等20發(fā)現(xiàn)鎳轉(zhuǎn)化細(xì)胞中有一與血小板反應(yīng)蛋白基因高度同源的DNA片斷丟失，血小板反應(yīng)蛋白基因在鎳轉(zhuǎn)化細(xì)胞中呈低表達(dá)。單克隆抗體證明該表達(dá)蛋白存在于正常細(xì)胞，而在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中大大減少，說明血小板反應(yīng)蛋白基因被抑制或失活。 三、鎳致原癌基因激活和抑癌基因失活的機(jī)制 一般說來，原癌基因和抑癌基因在正常細(xì)胞中都只處于低水平的表達(dá)，只有在生長信號的刺激下，進(jìn)入增殖時，癌基因才被激活，表達(dá)增強(qiáng)。例如ras基因被激活后，細(xì)胞明顯增殖，

9、而此時p53基因、Rb基因等抑癌基因表達(dá)也增強(qiáng)，對細(xì)胞的生長起負(fù)調(diào)控作用，待細(xì)胞生長停止后又復(fù)下降。但是如果原癌基因非正常表達(dá)增強(qiáng)或抑癌基因非正常失活，結(jié)果誘導(dǎo)細(xì)胞持續(xù)增生或惡變。已知鎳引起多種原癌基因激活及抑癌基因失活。據(jù)分析，導(dǎo)致這一變化的機(jī)制主要有點(diǎn)突變、缺失、擴(kuò)增、DNA甲基化、染色體濃縮等方式。 1.點(diǎn)突變：以ras癌基因?yàn)槔?，在鎳誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，多次觀察到鎳選擇性地引起H-ras或K-ras癌基因的第12密碼子GT的突變9，10，即從GCT變?yōu)镚TT，相應(yīng)的編碼氨基酸由甘氨酸變?yōu)槔i氨酸，單個堿基的變化使該基因處于激活狀態(tài)，ras基因表達(dá)增強(qiáng)。同時，氨基酸的變化改變了編碼蛋白p

10、21的構(gòu)象，使GAP(GTP酶結(jié)合蛋白)不能識別和激活p21的GTP酶，于是p21-GTP復(fù)合物不能水解成p21-GDP，p21處于持續(xù)活化狀態(tài)，使細(xì)胞持續(xù)增殖21。 抑癌基因的失活也可以通過堿基點(diǎn)突變發(fā)生。p53抑癌基因就是如此。在鎳誘導(dǎo)惡變細(xì)胞和鎳工肺癌細(xì)胞中均可見到該基因的點(diǎn)突變。例如：人腎上皮細(xì)胞受鎳轉(zhuǎn)化后，其p53基因的第238密碼子上發(fā)生TC的顛換，即由TGTCGT13，14；鎳工肺癌細(xì)胞可見GCTA的突變15。這些細(xì)胞的p53基因不能表達(dá)或表達(dá)極為低下。 2.丟失：基因丟失是基因失活的主要方式之一。在腸癌、肺癌等細(xì)胞常發(fā)生APC、Rb、p53、p16等抑癌基因的丟失。在鎳惡性轉(zhuǎn)化

11、細(xì)胞中，也常觀察到染色體缺失現(xiàn)象，例如17p，xq等部分缺失14，17，18，它們與p53及衰老基因的丟失有關(guān)。 3.基因擴(kuò)增：基因擴(kuò)增常常是癌基因激活及高表達(dá)的原因，染色體均染區(qū)(HSR)的出現(xiàn)被視為基因擴(kuò)增的可見證據(jù)22。在鎳所致腎肉瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞中就見到染色體均染區(qū)。同時，N-myc基因表達(dá)比正常細(xì)胞高6倍以上7，與人HL-60細(xì)胞N-myc基因擴(kuò)增時見到的細(xì)胞遺傳學(xué)變化一致。 4.堿基甲基化及染色質(zhì)濃縮：基因的甲基化狀態(tài)是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要方 式。DNA甲基化和染色體濃縮后造成的空間障礙，既不利于DNA的解鏈和解旋，又不利于轉(zhuǎn)錄因子與模板的結(jié)合，故基因表達(dá)失活或低下。一般而言，甲基化

12、的基因常不表現(xiàn)活性，而表達(dá)的基因常處于非甲基化或低甲基化狀態(tài)23。鎳可以通過堿基甲基化而影響基因的表達(dá)。例如，鎳轉(zhuǎn)化的中國倉鼠細(xì)胞的X染色體長臂缺失，呈永生性。當(dāng)往培養(yǎng)液中加入去甲基劑5-氮胞苷后，細(xì)胞逐漸衰老而死亡17。說明DNA甲基化是關(guān)閉衰老基因的原因。此外，由于鎳與異染色質(zhì)的H1組蛋白有特異性親和力，能誘導(dǎo)染色質(zhì)濃縮和甲基化。Lee等24證實(shí)鎳通過這種方式導(dǎo)致G12細(xì)胞的gpt基因關(guān)閉。他們觀察到：在鎳處理的培養(yǎng)細(xì)胞和游離核中，均可見到gpt基因特殊序列上DNA甲基化和染色質(zhì)濃縮，相關(guān)基因gpt表達(dá)失活。若激活gpt基因表達(dá)，則DNA甲基化和染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象消失。 5.鋅指(zinc f

13、inger)結(jié)構(gòu)的改變：鎳改變癌基因的表達(dá)可能與鋅指蛋白有關(guān)。鋅指蛋白是基因轉(zhuǎn)錄中反式作用因子結(jié)構(gòu)上的DNA識別或結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括鋅指、鋅扭(twist)和鋅簇(cluster)。其共同特點(diǎn)是通過螺旋結(jié)合于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的主溝中，參與基因轉(zhuǎn)錄，其活性依賴于鋅離子25。鋅指結(jié)構(gòu)富含半胱氨酸和組氨酸。由于鎳對半胱氨酸和組氨酸具有特殊的親和力，且與鋅同屬二價離子，故能與鋅競爭性結(jié)合氨基酸殘基，使鋅指變?yōu)椤版囍浮?，結(jié)果該結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲，不能折疊，失去原有的立體結(jié)構(gòu)，不能識別DNA特異位點(diǎn)，不能與之結(jié)合26。這可能是導(dǎo)致一些鎳轉(zhuǎn)化細(xì)胞中原癌基因失活不能表達(dá)的原因。此外，Sarker等27也發(fā)現(xiàn)鎳能取代鋅

14、指結(jié)構(gòu)中的鋅，不過作者認(rèn)為鎳取代鋅是為了與DNA結(jié)合，并通過產(chǎn)生自由基等損傷DNA，從而誘發(fā)腫瘤。從空間構(gòu)象上來說，前者更有說服力。 四、多基因變異與鎳致癌的關(guān)系 從以上研究可見，鎳不但激活原癌基因如c-ras、c-myc、c-fos、c-jun等的表達(dá)，而且能抑制抑癌基因如p53、Rb、衰老基因等的表達(dá)。它們在鎳致癌過程中如何起作用呢?     已經(jīng)知道細(xì)胞的增殖遵循細(xì)胞周期，即從G1SG2MG1。在細(xì)胞周期中至少存在兩個重要的“生長控制點(diǎn)”(checkpoints)，一是G1S轉(zhuǎn)變期；一是G2M轉(zhuǎn)變期。這兩控制點(diǎn)都由一些重要癌基因蛋白調(diào)控。它們不僅能

15、監(jiān)控細(xì)胞數(shù)量的增加，而且能監(jiān)視DNA損傷情況，阻止DNA損傷的細(xì)胞進(jìn)入分裂期。例如：c-myc基因的表達(dá)能使細(xì)胞獲得通過生長控制點(diǎn)的能力，而c-ras的表達(dá)則加強(qiáng)c-myc的這種作用。p53蛋白能使DNA損傷細(xì)胞停留在G1期，不進(jìn)入復(fù)制。在正常細(xì)胞中，癌基因的表達(dá)受細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)，也是周期性的。但腫瘤細(xì)胞中，基因表達(dá)程度和次序發(fā)生紊亂，不再具有周期特異性。例如：在苯并(a)芘轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，c-myc持續(xù)性高表達(dá)，不具周期性，故細(xì)胞持續(xù)增殖。再如p53等抑癌基因失活，則損傷細(xì)胞仍可復(fù)制、增殖。鎳誘導(dǎo)染色體畸變和DNA損傷已從許多方面得到了證實(shí)，而且由于多方面的作用，鎳能引起原癌基因的激活和抑癌基因

16、的失活。這樣，一方面使得受損細(xì)胞能越過第一生長控制點(diǎn)(G1S)，同時由于p53、Rb等監(jiān)控基因的失活，具有DNA損傷的細(xì)胞也進(jìn)入分裂期(G2M)，使細(xì)胞癌變成為可能，并且在原癌基因大量表達(dá)的情況下，腫瘤的演變加速。 五、結(jié)語 綜上所述，鎳引起培養(yǎng)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和鎳工肺癌的過程是一個多基因參與和多基因變異的過程。這些研究為進(jìn)一步尋找與鎳致癌相關(guān)的基因提供了依據(jù)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的癌變相關(guān)基因就有100多種，而在鎳致癌的研究中，前后發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因也不過10來種。很顯然，就鎳誘發(fā)的染色體、DNA損傷的復(fù)雜、多樣性來看，與鎳致癌相關(guān)的基因遠(yuǎn)不只上述幾個，還有更多的基因有待研究。   

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