HPLC方法開發(fā)與驗(yàn)證

1、液相方法開發(fā)液相方法開發(fā)創(chuàng)諾集團(tuán)分析技術(shù)研究所紀(jì)偉20160903液相色譜原理儀器原理色譜分離機(jī)制液相色譜的分離機(jī)理 正相 反相 體積排除 離子交換 其他 不同的分離模式是不同的機(jī)理吸附色譜的分離機(jī)理 隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小 在色譜柱上的保留由長(zhǎng)到短 吸附色譜概述分離基于樣品的極性差異。洗脫次序 一般為正相，即：極性低的先被洗脫常用的流動(dòng)相 非極性有機(jī)溶劑，如己烷 乙酸等為添加劑常用固定相 硅膠、氧化鋁、羥基磷灰石等。分配色譜的分離機(jī)理分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用的流動(dòng)相： 有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水 應(yīng)用添加劑，成

2、為離子對(duì)、離子抑制方法常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基團(tuán) 反相色譜固定相多為鍵合相體積排除色譜的分離機(jī)理凝膠色譜概述 凝膠滲透（GPC）、凝膠過濾（GFC） 分離基于分子在溶液中的體積大小 洗脫次序：大分子先被洗脫 流動(dòng)相不參與分離，只起溶劑作用 分離效率低 色譜行為容易預(yù)測(cè)離子交換樹脂的分離機(jī)理離子交換色譜概述適用于離子型化合物的分離分離基于離子的帶電特性洗脫次序受多種因素的影響 填料（離子交換樹脂）的種類 陰/陽，強(qiáng)/弱，交換基團(tuán) 樣品分子特性 鹽的種類、濃度 溫度及pH值 有機(jī)溶劑SP CS PCSPSP t 樣品填料分析方法開發(fā)選HPLC參數(shù)時(shí)的基本考慮溶解度 - 選擇流動(dòng)相的條件

3、分子量 - 在樣品預(yù)處理時(shí)有用官能團(tuán) - 有否離子化基團(tuán) 保留特性如何 檢測(cè)特性 - 有否紫外吸收 熒光 找出樣品中不同組份之間的差異 摸索條件的重要線索HPLC方法建立的步驟3 選擇儀器類型，確定檢測(cè)器及其參數(shù)2 是否需要樣品預(yù)處理，是否有特殊的步驟1 了解樣品的有關(guān)情況，明確分析目的7a 回 收 純 化 物 質(zhì)8 方 法 論 證 進(jìn) 入 常 規(guī) 實(shí) 驗(yàn) 室7b 定 量 校 正7c 定 性 方 法6 檢 查 出 現(xiàn) 的 各 種 現(xiàn) 象 和 問 題 (包 括 儀 器 、 樣 品 穩(wěn) 定 性 等 ） 選 擇 解 決 辦 法 和 特 殊 步 驟5 優(yōu) 化 分 離 條 件 ， 選 擇 最 佳 檢 測(cè)

4、 器 參 數(shù) 、 色 譜 柱 、 流 動(dòng) 相 比 例 等4 選 擇 液 相 色 譜 分 離 類 型 ， 色 譜 柱 ， 流 動(dòng) 相 ， 其 他 相 關(guān) 條 件 （ 如 波 長(zhǎng) 等 ） ， 進(jìn) 行 預(yù) 實(shí) 驗(yàn) ， 估 計(jì) 最 佳 條 件流動(dòng)相的選擇 有機(jī)相： 常用做反相流動(dòng)相的溶劑是甲醇和乙腈： 甲醇有其性價(jià)比的優(yōu)勢(shì)，但是甲醇活性高，可能與某些樣品發(fā)生反應(yīng)，而且甲醇在低波長(zhǎng)下有紫外吸收，會(huì)降低分析方法的靈敏度； 乙腈雖然價(jià)格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強(qiáng)，很少與樣品發(fā)生反應(yīng)，用作流動(dòng)相系統(tǒng)壓力要比甲醇低很多，且截止波長(zhǎng)比甲醇低20nm，增加了檢測(cè)出在低波長(zhǎng)下才有吸收的雜質(zhì)的可能性，所以

5、我們一般傾向于多用乙腈，少用甲醇。但是有時(shí)候樣品峰形不好或者分離不好，更換溶劑試試是一個(gè)很好的選擇，畢竟不同的溶劑提供不同的選擇性。水相： 對(duì)流動(dòng)相的優(yōu)化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加堿、加鹽，從而改善峰形、提高分離度。 流動(dòng)相里加堿的情況比較少，主要還是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波長(zhǎng)下沒有紫外吸收，而三氟乙酸在低波長(zhǎng)下有，但是三氟乙酸易揮發(fā)而磷酸不行，所以單純做液相，低波長(zhǎng)下磷酸最合適，三氟乙酸有吸收，運(yùn)行梯度時(shí)基線漂移很嚴(yán)重，而做液質(zhì)就要考慮首選三氟乙酸了。 水溶液中添加0.1%（體積）的磷酸或者三氟乙酸其p

6、H值大概在2左右，用作流動(dòng)相正好抑制硅羥基的活性，所以開發(fā)液相分析方法時(shí)流動(dòng)相首選水加0.1%的磷酸，然后再以此為基礎(chǔ)做優(yōu)化。在單獨(dú)用酸不行的時(shí)候就要考慮使用緩沖鹽，緩沖鹽的選擇原則是：簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、緩沖能力強(qiáng)、配制簡(jiǎn)單，需要調(diào)pH值時(shí)要有相應(yīng)的酸或堿。常用的緩沖鹽是磷酸鹽，主要是鉀鹽和鈉鹽，再有就是醋酸鹽，常用的鹽濃度在1020mM左右。流動(dòng)相里有時(shí)會(huì)需要調(diào)節(jié)pH值到堿性，具體pH要視色譜柱的耐受范圍而定。在緩沖鹽做流動(dòng)相時(shí)，出峰太早、峰形很差、相似結(jié)構(gòu)的化合物峰因?yàn)橥衔不蚍逍吞珜挾荒苓_(dá)到基線分離時(shí)，可以考慮使用離子對(duì)試劑，常用的離子對(duì)試劑主要是各種烷基磺酸鈉和四丁基銨鹽，但是流動(dòng)相里使用離

7、子對(duì)試劑時(shí)，系統(tǒng)需要的平衡時(shí)間長(zhǎng)，樣品保留時(shí)間不是很穩(wěn)定，因?yàn)殡x子對(duì)試劑的背景吸收基線會(huì)很差，且做完樣品后需要長(zhǎng)時(shí)間清洗，所以我們盡量不使用離子對(duì)試劑。使用緩沖鹽時(shí)要注意流動(dòng)相混合以后鹽可能析出的問題和鹽背景吸收導(dǎo)致基線漂移嚴(yán)重的問題，可以考慮在乙腈里加入10%的水，水中預(yù)先加入10倍水溶液濃度的緩沖鹽，這樣梯度中A、B兩項(xiàng)鹽的濃度相同，可以避免基線漂移嚴(yán)重的問題。原料藥一般結(jié)構(gòu)式比較大，分子構(gòu)成比較復(fù)雜，開發(fā)分析方法時(shí)用水加磷酸效果可能效果不好，通常還要求最少嘗試2和6.5兩個(gè)pH值的磷酸鹽緩沖溶液，并依據(jù)結(jié)果對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行pH優(yōu)化，如效果不理想再進(jìn)一步嘗試其它緩沖鹽溶液。開發(fā)中間體或者IPC

8、的分析方法時(shí)可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)酌情簡(jiǎn)化流動(dòng)相的選擇過程。 保留時(shí)間保留時(shí)間酸性組份酸性組份中性組份中性組份堿性組份堿性組份 方法穩(wěn)定區(qū)方法穩(wěn)定區(qū) 方法波動(dòng)區(qū)方法波動(dòng)區(qū)(pKa+1.5) 方法穩(wěn)定區(qū)方法穩(wěn)定區(qū)液相柱-保留值與pH的關(guān)系反相反相HPLC常用緩沖液常用緩沖液 緩沖液緩沖液pKapH范圍范圍磷酸鹽磷酸鹽pK12.11.13.1檸檬酸鹽檸檬酸鹽pK13.12.14.1甲酸鹽甲酸鹽3.82.8 4.8 檸檬酸鹽檸檬酸鹽pK24.73.75.7 乙酸鹽乙酸鹽4.83.85.8 檸檬酸鹽檸檬酸鹽pK35.44.46.4 磷酸鹽磷酸鹽pK27.26.28.2羥甲基甲胺羥甲基甲胺8.37.39.3 氨氨

9、9.28.210.2 硼酸鹽硼酸鹽9.28.210.2 甘氨酸甘氨酸9.88.810.8 1-甲基甲基-哌啶哌啶10.39.311.3 四氫化吡咯四氫化吡咯10.59.511.5 二乙胺二乙胺10.59.511.5 三乙胺三乙胺10.79.711.7 磷酸鹽磷酸鹽pK312.311.313.3pH 2.5磷酸磷酸 0.1%三氟乙酸三氟乙酸 0.1%梯度的優(yōu)化 梯度優(yōu)化主要是通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的起始比例和梯度的斜率來調(diào)整樣品的保留時(shí)間，優(yōu)化樣品的分離度。有機(jī)相起始比例越小，樣品保留時(shí)間越長(zhǎng)，隨著梯度的改變，樣品出峰的先后順序也有可能改變。為了提高樣品的分離度，盡量使用大比例的水做梯度的起始。對(duì)于添加

10、緩沖鹽的流動(dòng)相要注意梯度變化過程中流動(dòng)相組成改變時(shí)不能有鹽析出。對(duì)于水加0.1%磷酸的流動(dòng)相，開始時(shí)可以采用95%的水做起始，以95%的有機(jī)相結(jié)束,梯度的斜率一般采用凹線型的先小后大，梯度變化先慢后快，在此基礎(chǔ)上再對(duì)梯度進(jìn)行優(yōu)化。使用緩沖鹽溶液的梯度水相起始比例一般要從1020%開始，為了防止鹽析出，在梯度最后避免用純的有機(jī)相做沖洗。一般一個(gè)API的樣品采集的時(shí)間控制在4050分鐘左右，樣品出峰在1520分鐘左右比較好，如果有極性非常小的雜質(zhì)存在可以在最后加一段時(shí)間的大比例有機(jī)溶劑沖洗色譜柱，最后再設(shè)置10分鐘左右的重新平衡時(shí)間。中間體和IPC的樣品分析方法時(shí)間可以根據(jù)需要減半或者時(shí)間更短。波

11、長(zhǎng)的選擇 首先考慮流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)：甲醇截止波長(zhǎng)為205nm;乙腈截止波長(zhǎng)為190 nm;一般而言,大于上述波長(zhǎng)都可以,但有時(shí)候?yàn)榱吮ＷC靈敏度,高于20nm。 對(duì)于中間體或終產(chǎn)品液相方法中波長(zhǎng)選擇一般是將雜質(zhì)和目標(biāo)產(chǎn)物混合到儀器進(jìn)樣，采用DAD全波段掃描，對(duì)比雜質(zhì)及目標(biāo)產(chǎn)物光譜吸收曲線，盡量在目標(biāo)產(chǎn)物最大吸收附近兼顧雜質(zhì)吸收，得出最優(yōu)吸收波長(zhǎng)，當(dāng)一些雜質(zhì)與主峰或其他幾個(gè)雜質(zhì)吸收差異比較大時(shí)考慮使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)法。分析方法驗(yàn)證分析方法驗(yàn)證方法驗(yàn)證，說白了就是對(duì)方法進(jìn)行一次全身體檢 為了保證分析檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，必須對(duì)所采用的分析方法的準(zhǔn)確性、科學(xué)性和可行性進(jìn)行驗(yàn)證，以證明分析方法符合檢測(cè)的目的和

12、要求，這就是分析方法驗(yàn)證。 方法驗(yàn)證在質(zhì)量控制上有重要的作用和意義，只有經(jīng)過驗(yàn)證的分析方法才能用于藥品生產(chǎn)的分析檢測(cè)，方法驗(yàn)證是制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。方法驗(yàn)證內(nèi)容包括方法的專屬性、線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度、檢出限、定量限、耐用性和系統(tǒng)適用性等，檢測(cè)目的不同驗(yàn)證要求也不盡相同。1.專屬性 專屬性是指分析方法能夠?qū)a(chǎn)品和雜質(zhì)分開的特性，也稱為選擇性。對(duì)于純度檢測(cè)，可在標(biāo)準(zhǔn)品中加入產(chǎn)品中的已知雜質(zhì)，或者直接用粗品，考察產(chǎn)品峰是否受到雜質(zhì)的干擾，對(duì)于過程跟蹤，可用反應(yīng)體系樣品來考察有沒有其它的雜質(zhì)干擾。必要時(shí)使用二極管陣列檢測(cè)器或者質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰純度檢查。一般要求產(chǎn)品和雜質(zhì)之間的分離度大于2.0

13、。2.線性 線性是在設(shè)定的范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果與樣品中原料或產(chǎn)品的濃度呈線性關(guān)系的程度。線性是定量檢測(cè)的基礎(chǔ)，需要定量檢測(cè)的項(xiàng)目都需要驗(yàn)證線性。一般用貯備液經(jīng)過精密稀釋，或分別精密稱樣，制備得到一系列被測(cè)物質(zhì)的濃度（5個(gè)以上），按濃度從小到大運(yùn)行序列，以峰面積和濃度的函數(shù)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸計(jì)算，考察分析方法的線性。3.范圍 范圍指在能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性時(shí)，樣品中被分析物的濃度區(qū)間。簡(jiǎn)單的說，范圍就是分析方法適用的樣品中待測(cè)物的濃度最大值和最小值。需要定量檢測(cè)的分析方法都需要對(duì)范圍進(jìn)行驗(yàn)證，純度檢測(cè)時(shí)，范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的80120。4.準(zhǔn)確度 準(zhǔn)確度是指測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值之

14、間接近的程度，所以也叫做真實(shí)度，需要定量得分析方法均需要驗(yàn)證準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立，對(duì)于原料藥可用已知純度的標(biāo)準(zhǔn)品或符合要求的原料藥進(jìn)行測(cè)定，必要時(shí)可與另一個(gè)已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。5.精密度 精密度是指在規(guī)定條件下，同一均勻樣品經(jīng)多次取樣進(jìn)行一系列檢測(cè)所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，取樣檢測(cè)次數(shù)應(yīng)至少6次。精密度可以從三個(gè)層次考察：重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性。a、重復(fù)性是在相同的操作條件下、較短時(shí)間間隔內(nèi)，由同一分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度。一般是用100濃度水平的樣品測(cè)定6次的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。b、中間精密度：同一實(shí)驗(yàn)室，在日期、分析人員、儀器等內(nèi)部條件改

15、變時(shí)，測(cè)定結(jié)果的精密度。 c、重現(xiàn)性：指不同實(shí)驗(yàn)室之間不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。6.檢出限 檢出限是指樣品中的被分析物能夠被檢測(cè)到的最低量，不需要準(zhǔn)確定量。檢出限體現(xiàn)了分析方法的靈敏度。檢出限的測(cè)定可以通過對(duì)一系列已知濃度被測(cè)物的試樣進(jìn)行檢測(cè)，以能準(zhǔn)確、可靠檢出被測(cè)物的最小濃度來確定，也可把已知濃度樣品的信號(hào)與噪聲信號(hào)進(jìn)行比較，以信噪比為3：1時(shí)的濃度確定檢出限，一般要求能夠達(dá)到進(jìn)樣濃度的0.05%。7.定量限 定量限是指樣品中的被分析物能夠被定量檢測(cè)的最低量，其測(cè)定結(jié)果需要一定的準(zhǔn)確度和精密度，定量限體現(xiàn)了分析方法靈敏定量檢測(cè)的能力。檢測(cè)需要嚴(yán)格控制含量的雜質(zhì)，必須考察方法的定量限，以保證雜質(zhì)能夠被準(zhǔn)確定量。一般以信噪比為10：1時(shí)相應(yīng)的濃度或進(jìn)樣量來確定定量限。8.耐用性 耐用性是指測(cè)定條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，耐用性主要表明方法的抗干擾能力，主要的變動(dòng)因素包括：流動(dòng)相的組成、流速和pH值、色譜柱、柱溫等。經(jīng)試驗(yàn)，應(yīng)說明小的變動(dòng)能否符合系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，以確保方法有效。9.系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 液相色譜分析方法主要依賴高效液相色譜儀和色譜柱，在做方法驗(yàn)證時(shí)，有必要將高效液相色譜儀、色譜柱、流動(dòng)相與實(shí)驗(yàn)操作、待測(cè)樣品等一起當(dāng)作完整的系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，并將系統(tǒng)適用性作為分析方法的組成部分，系統(tǒng)適用性便是對(duì)整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估的指標(biāo)。一般系統(tǒng)適應(yīng)性的要求為：