地高辛標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記方法

1、地高辛標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記方法Last revision on 21 December 2020地高辛標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記方法核酸探針已被廣泛用于篩選重組克隆、基因多樣性的種性檢測(cè) 和真菌種群內(nèi)及種群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系評(píng)價(jià)。最早使用的放射 性同位素標(biāo)記核酸探針具有敏感性高、特異性好、分辨力強(qiáng)的特 點(diǎn)，但放射性同位素標(biāo)記也存在著一系列令人困擾的問(wèn)題,如成本 高、探針半衰期短、放射性物質(zhì)危害人體健康等。而且在進(jìn)行放 射性同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí),需要有專門(mén)的實(shí)驗(yàn)室及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)保護(hù)設(shè) 施，還需要由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專業(yè)人員來(lái)操作，因而限制了在普通實(shí)驗(yàn) 室進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。近幾年發(fā)展起來(lái)的非放射性核酸探針大多通過(guò)酶促、

2、光化學(xué) 和化學(xué)手段摻入一種報(bào)道基團(tuán),這種報(bào)道基團(tuán)可通過(guò)高靈敏度的冷 光、熒光或金屬沉淀等檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。另外，應(yīng)用pH電極或感應(yīng) 器技術(shù)的電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)也有報(bào)道。在這些檢測(cè)系統(tǒng)中，靈敏度最 高的是生物素親合素檢測(cè)系統(tǒng)和半抗原抗半抗原地高辛檢測(cè)系 統(tǒng)。由于生物樣品中常含有內(nèi)源性生物素及生物結(jié)合蛋白，生物 素標(biāo)記的核酸探針會(huì)發(fā)生一些非特異性結(jié)合，從而影響實(shí)驗(yàn)效 果。與生物素親合素系統(tǒng)同樣具有高靈敏度，卻減少了非特異性 結(jié)合的地高辛檢測(cè)系統(tǒng)，已為人們所接受,并得到廣泛的應(yīng)用。地高辛(Digoxigenin ,DIG)又稱異理基洋地黃毒貳元，是一種 類固醇半抗原分子。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。采用人工方法可

3、以將地高辛的線型間隔臂與dUTP連接起來(lái), 形成DIG-11-dUTP,通過(guò)隨機(jī)引物法或PCR法將其摻入到DNA 探針中。RNA探針的標(biāo)記是使用噬菌體信息編碼的RNA聚合 酶，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄將DIG-11-dUTP摻入到RNA探針中。寡核昔 酸探針的標(biāo)記則是通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶催化，在3,末端加上DIG-11- dUTP/dATP 或 DIG-11-ddUTP 尾巴。對(duì)于目的DNA或RNA來(lái)說(shuō)，分子雜交后，雜交部分可通過(guò) ELISA實(shí)驗(yàn)程序加以檢測(cè)，即加入一種結(jié)合有堿性磷酸酶的地高 辛特異性抗體，它與地高辛半抗原分子形成酶聯(lián)抗體半抗原 (DIG)復(fù)合物，再加入相應(yīng)的顯色底物，使雜交部分得以顯示。1地高

4、辛標(biāo)記核酸探針的主要標(biāo)記方法1.1 DNA探針的標(biāo)記方法1.1.1 PCR摻入法這種標(biāo)記方法是通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在Taq酶的作用下，將DIG-11-dUTP摻入到新合成的DNA 鏈中。以本法標(biāo)記的探針不但靈敏度高，產(chǎn)量也很高。少量的基 因組DNA(lng 50ng)便可直接通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增、標(biāo)記。1. 1.2 隨機(jī)引物法用隨機(jī)引物法可將DIG-11-dUTP標(biāo)記于DNA鏈上。為得到最佳標(biāo)記效果，標(biāo)記前模板DNA需作線 性處理，而且至少要用苯酚氯仿進(jìn)行一次抽提，再用乙醇沉淀。10010000堿基的模板鏈均可被有效地標(biāo)記，但大于10000堿基 的模板鏈則需要在標(biāo)記前作限制酶切消化。處理好的模板

5、加入隨 機(jī)引物，按堿基互補(bǔ)原則，隨機(jī)引物與模板DNA退火后由 Klenow片段從引物3f端延伸引物，便可將DIG-11-dUTP均勻摻 入到新合成的DNA鏈中。1.1.3 切口平移法切口平移法DNA探針技術(shù)快速簡(jiǎn)便，且已非常成熟。先用適量的DNase I在雙鏈DNA ±打開(kāi)若干 個(gè)單鏈缺口 ,然后在E. coli DNA聚合酶I的51- 3f外切活性和聚 合活性的共同作用下，在缺口的亍端切除單鏈DNA序列，隨之 由新合成的帶有地高辛標(biāo)記的脫氧核昔酸鏈取代。本法適用于環(huán)形DNA或大于lkb DNA片段的標(biāo)記。用于原位雜交的核酸 探針，通過(guò)切口平移法標(biāo)記最為有效。因?yàn)榇朔椒赏ㄟ^(guò)控制 D

6、Nase I的酶活性得到適當(dāng)?shù)娜笨?，從而得到長(zhǎng)度大小適宜的探 針，而探針的大小是原位雜交的一個(gè)重要參數(shù)，足夠小的探針才 可能穿透組織或細(xì)胞。1. 2寡核昔酸探針的標(biāo)記方法合成的寡核昔酸探針被廣泛應(yīng)用于篩選基因文庫(kù)、Southern 印跡、Northem印跡、斑點(diǎn)印跡及原位雜交試驗(yàn)。地高辛標(biāo)記寡 核昔酸有三種方法3末端標(biāo)記、5'末端標(biāo)記以及在探針3*端加上 數(shù)個(gè)DIG-11-dUTP分子的尾巴（圖2）o1. 2.1 3*末端標(biāo)記法3,末端標(biāo)記法的主要特點(diǎn)是在每個(gè)合成的寡核昔酸（長(zhǎng)度為14lOObp）的引末端只添加一個(gè)地高辛 殘基（DIG-ddU TP）O用此方法標(biāo)記寡核昔酸時(shí)，除末端轉(zhuǎn)移

7、酶外，無(wú) 需其它特別的寡核昔酸合成試劑，方便快捷。所合成的探針適合于 要求探針具有較高的特異性而靈敏度一般的試驗(yàn)，如Southern印 跡、Northem印跡、斑點(diǎn)印跡及菌落P噬菌斑雜交實(shí)驗(yàn)。1.2.2 5,末端標(biāo)記法5,末端標(biāo)記法是通過(guò)化學(xué)方法將地高辛標(biāo)記于寡核昔酸的亍末端。首先在亍末端連接上一個(gè)氨基 連接臂殘基，將合成的寡核昔酸純化后，再使DIG-NHS與51末端的 氨基殘基發(fā)生共價(jià)結(jié)合,從而形成標(biāo)記探針。這類探針的一個(gè)主要 優(yōu)點(diǎn)是其3f端在DNA合成反應(yīng)中充當(dāng)引物，使反應(yīng)產(chǎn)物得以標(biāo) 記。1. 2. 3 3,末端加尾法3,末端加尾法是由末端轉(zhuǎn)移酶在探針引末端加上數(shù)個(gè)地高辛殘基的尾巴。此方法

8、標(biāo)記的探針靈敏度 較引末端標(biāo)記法要高出10倍左右，但由于存在長(zhǎng)尾巴，往往會(huì)出現(xiàn) 較嚴(yán)重的非特異性背景。1.3 RNA探針的標(biāo)記方法通過(guò)RNA聚合酶SP6、T7或T3經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄可將地高辛標(biāo) 記于RNA探針上。用地高辛標(biāo)記的RNA探針具有很強(qiáng)的信號(hào)能 力，且非特異性背景少，在Southern印跡和Northem印跡實(shí)驗(yàn)中，效 果明顯優(yōu)于同為地高辛標(biāo)記的DNA探針，可與放射性同位素標(biāo)記 探針相媲美。另外，在篩選菌落P噬菌斑及原位雜交的實(shí)驗(yàn)中RNA 探針也同樣具有良好的效果。而且，由于DIG與UTP之間的鍵合 對(duì)堿性不敏感，可通過(guò)堿處理方法得到所需大小的探針。2影響 探針標(biāo)記方法選擇的因素使用地高辛系

9、統(tǒng)時(shí)，可根據(jù)地高辛系統(tǒng)的不同用途、所獲得 的用以制備探針的模板類型、以及探針可達(dá)到的靈敏度，選擇探針 標(biāo)記方法?？傮w而言,DNA模板的純度越高,標(biāo)記的效率也越高。在進(jìn)行標(biāo)記前，應(yīng)使用苯酚、氯仿抽提DNA模板。此外，對(duì)于隨機(jī) 引物標(biāo)記DNA的方法而言，在標(biāo)記反應(yīng)之前,先將模板線性化并加 熱變性是至關(guān)重要的;而對(duì)寡核昔酸來(lái)說(shuō)，在其3*末端加上DIG-11- dUTP的尾巴前，應(yīng)該先經(jīng)過(guò)凝膠或HPLC純化。3雜交技術(shù)使用地高辛標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行分子雜交，其雜交動(dòng)力學(xué)、 雜交條件與放射性同位素標(biāo)記的探針相似。探針的性質(zhì)不同，雜交 溫度和時(shí)間也不同:DNAP不含甲酰胺:雜交溫度為68 C。,時(shí)間 &am

10、p;ge;6h ;DNAP含50 %甲酰胺:雜交溫度為42 C。,時(shí)間≥6h ;寡核 昔酸P不含甲酰胺:雜交溫度為54 C。,時(shí)間16h RNARNA雜交 （RNA探針）:雜交溫度為68 C。,時(shí)間≥6h RNADNA雜交（DNA 探針）:雜交溫度為50 C。,時(shí)間≥6h o地高辛標(biāo)記探針的一個(gè)最重要的優(yōu)點(diǎn)就是穩(wěn)定性很強(qiáng)。分子 雜交后，雜交液中仍舊含有大量沒(méi)有退火的地高辛標(biāo)記探針,只要將 這些剩余溶液倒回塑料試管中，分別在20 C°（DNA探針）和.70 C° （RNA探針）妥善儲(chǔ)存,其穩(wěn)定性至少可以保持一年之久。在使用這 些探針時(shí)

11、只需解凍后加熱至95 C。,變性lOmin即可。如果雜交液 中含有甲酰胺，則需68 C。變性10mino此外，在雜交這一環(huán)節(jié)中，為了避免探針濃度過(guò)高而產(chǎn)生干擾背 景，有必要在正式雜交前先進(jìn)行一次模擬雜交,以篩選最適的濃度。 4地高辛標(biāo)記探針的顯色檢測(cè)4.1化學(xué)發(fā)光檢測(cè)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)能通過(guò)X光片記錄下很輕微的信號(hào)，其檢測(cè)過(guò) 程分四個(gè)步驟完成。首先使用封閉劑對(duì)雜交后的膜進(jìn)行處理，以阻 止抗體對(duì)膜的特異性吸引，然后加入結(jié)合有堿性磷酸酶的抗地高辛 半抗原的抗體(Anti-DIG-AP)，形成酶聯(lián)抗體半抗原復(fù)合物,再加入 化學(xué)發(fā)光底物 CSPD 或 CDP-StarTM(Boehringer Mannheim 公司的 產(chǎn)品)，使其與膜上的雜交探針?biāo)Y(jié)合的抗體復(fù)合物充分反應(yīng)，最后 在X光片上曝光，以記錄化學(xué)發(fā)光信號(hào)?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)在尼龍膜上 的效果優(yōu)于在纖維素膜上的效果。4. 2