細(xì)胞模型試驗(yàn)報(bào)告精編版

1、最新資料推薦廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告科目： 細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)?zāi)昙?jí)： 研究生院2016級(jí)組別： A組12學(xué)號(hào):*姓名:*實(shí)驗(yàn)二MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用實(shí)驗(yàn)原理：MTT比色法原理是活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的MTT還原為藍(lán)紫色的結(jié)晶甲 臜。后者結(jié)晶產(chǎn)物的量與活細(xì)胞數(shù)目成正相關(guān)，而死細(xì)胞或紅細(xì)胞沒(méi)有此功能。結(jié)晶用DMSO、無(wú)水乙醇、酸化異丙醇等溶解， 在酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng)為 490 nm進(jìn)行比色，所檢測(cè)吸光值 的大小可反應(yīng)細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)步驟：1:貼壁細(xì)胞消化和吹打：加1ml0.5%胰蛋白酶并輕搖使其遍布所有細(xì)胞表面至鏡下觀察發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、間隙增大停止，倒掉，加入含小牛血清的培養(yǎng)液，反

2、復(fù)吹打至瓶壁上無(wú)貼壁細(xì)胞為 止。2:計(jì)數(shù)與分板：取20ul細(xì)胞懸液于計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用1640培養(yǎng)液調(diào)整使其細(xì)胞數(shù)約為 5X 104 個(gè)/ml，在96孔培養(yǎng)板中加入細(xì)胞懸液每孔100ul，共18個(gè)，培養(yǎng)箱孵育12h。3 :加藥與孵育于培養(yǎng)板中分別加入濃度為0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mg/ml環(huán)磷酰胺注射液各 100ul，每組重復(fù)3孔,設(shè)空白對(duì)照組 3孔各100ul,孵育24小時(shí)。4: MTT顯色每孔加 MTT20UI , 3小時(shí)候棄上清，每孔加 DMSO100ul。5:酶標(biāo)儀測(cè)定：490nm處測(cè)其吸光度00.511.522. 533.張度對(duì)數(shù)值3.2041199831.18982911

3、2.9030899871.014000412. 602059910. 985814292.3010299960. 90&5266620. 8497014600. 604S942&實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論：1不同濃度藥物的生長(zhǎng)抑制率如下濃度（ug/ml）平均吸光度（x± s）抑制率（%）存活率（%）1600-0.15367-18.98%118.98%800-0.01133-1.40%101.40%4000.25433331.42%68.58%2000.0756679.35%90.65%1000.12166715.03%84.97%00.3239.53%60.47%2濃度與抑制率關(guān)

4、系圖濃度對(duì)議值注：橫坐標(biāo)為濃度對(duì)數(shù)值、縱坐標(biāo)為抑制率3. 討論：1. 本次實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)錯(cuò)誤較多， OD 值出現(xiàn)負(fù)值和其中還有 400ug/ml 組加懸液過(guò)量， 致使數(shù)據(jù)有 所偏離。2. 加 DMSO 之后顏色對(duì)比明顯，并且梯度效果比較好，平行孔間顏色較均勻，隨濃度梯度 變化相對(duì)明顯，能夠體現(xiàn)出抑制作用。3. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)過(guò)少不能夠完全判定藥物的抑制作用，另因?yàn)槿绻變?nèi)的細(xì)胞狀態(tài)不好也有可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)三HE染色法觀察藥物作用細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)變化實(shí)驗(yàn)原理：HE染色法采用兩種染料即堿性染料蘇木素和酸性染料伊紅分別與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)發(fā)生作用，使細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)通過(guò)顏色而改變它的折射率，從而在光鏡下能清晰顯示出

5、細(xì)胞圖像，染色的結(jié)果是酸性的細(xì)胞核被堿性的蘇木素染成藍(lán)色，堿性的細(xì)胞質(zhì)被酸性的伊紅染成紅色。實(shí)驗(yàn)步驟：1. 樣品制備：胰酶消化貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 105個(gè)/ml,每孔2ml加于6孔板, 加蓋玻片，加入藥物培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間，取出蓋玻片，用 PBS洗滌3次。2. 樣品固定：95%乙醇固定20min后PBS清洗2次。3. 染細(xì)胞核：蘇木精染色5-10min后自來(lái)水水洗。4. 染細(xì)胞質(zhì)：伊紅染色1-2min后自來(lái)水水洗。5. 脫水、透明：70%, 95%, 100%乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，吹干。6. 封片:在載玻片上滴加甘油，將有細(xì)胞的一片的蓋玻片向下封固于載玻片上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：耆*

6、 *染色的結(jié)果是酸性的細(xì)胞核被堿性的蘇木素染成藍(lán)色，堿性的細(xì)胞質(zhì)被酸性的伊紅染成紅色。如圖所示染色的結(jié)果隨藥物濃度變化而變化，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用較為明顯，并且體現(xiàn)出濃度趨勢(shì)，整體的染色效果尚可 。實(shí)驗(yàn)四 吖啶橙熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化實(shí)驗(yàn)原理：吖啶橙是一種與 DNA和RNA都能結(jié)合的熒光染料，在藍(lán)色光或紫外光的激發(fā)下，DNA和RNA 都會(huì)激發(fā)出熒光，活細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定，染色后細(xì)胞DNA成亮綠色，核仁和散布在細(xì)胞質(zhì)中的RNA成橘紅色，胞質(zhì)的其余部分為淡紅褐色。死亡的細(xì)胞，因?yàn)槲镔|(zhì)就夠發(fā)生變化，其細(xì)胞核成暗綠色，細(xì)胞質(zhì)也是成暗綠色。實(shí)驗(yàn)步驟：1. 胰酶消化貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 105

7、 /ml,每孔2ml加于6孔板，加蓋玻片加入藥 物培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，除去血清2. 95% 乙醇固定 1530mi n3. 1%醋酸作用 30s, 1 X 10-4AO 染色 30s60s, 0.1M CaCI2 處理 30s2min4. PBS漂洗3次5. 甘油封片 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析:對(duì)照組IC50組正常細(xì)胞染色后發(fā)出綠色熒光，密度不均勻呈結(jié)構(gòu)樣特征，而凋亡小體邊緣清晰， 呈染色增強(qiáng)，熒光亢進(jìn)且密度均一， 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)照明顯，可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量在加藥組減少。有細(xì)胞正在進(jìn)行分化，還有分化剛剛結(jié)束有細(xì)胞正在進(jìn)行分化，還有分化剛剛結(jié)束。實(shí)驗(yàn)五TRIzo試劑快速分離細(xì)胞和

8、組織中的 RNA、DNA、蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)原理：TRIzol試劑是目前最常用的細(xì)胞和組織中分離RNA的試劑，其主要成分是苯酚，苯酚的作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白和核酸物質(zhì)釋放，由于RNA極易被RNase分解， 所以TRIzol中常加入8羥基喹啉，異硫氰酸胍等來(lái)抑制內(nèi)源性和外源性RNase活性，以保證RNA完整。TRIzol試劑還利用 RNA、DNA、蛋白質(zhì)在不同溶液中的溶解性質(zhì)，加入氯仿離心后，溶液分為水相、中間層和有機(jī)相，取出水相用異丙醇沉淀可 回收RNA用乙醇沉淀中間層可回收DNA,用異丙醇沉淀可回收蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)三者快速分離。實(shí)驗(yàn)步驟：樣品處理：TRIzol處理后的樣品在室溫放置5min,

9、每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置3min，離心15min.樣品分三層：底層為紅色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè) 中間層.RNA主要在水相，中間層和有機(jī)層用于分離DNA和蛋白質(zhì)。RNA :放置干燥RNA沉淀，用無(wú) Rnase水在55-60度下溶解RNA取2ul樣品用核算微量檢測(cè)儀測(cè)量RNA濃度另取2ul在瓊脂糖凝膠中跑電泳DNA:75%乙醇洗DNA沉淀后再離心試問(wèn)晾干后NaOH溶解，再用TE HEPES調(diào)節(jié)PH取2ul在核算微量檢測(cè)儀上測(cè)量DNA濃度蛋白質(zhì)：室溫晾干后1%SDS溶解蛋白質(zhì)雙縮脲試劑檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：1、RNA電泳圖如下：可以看到 28,18s

10、, 5s三條條帶2.OD（ 260nm） /OD（ 280nm ）濃度RNA1.791192.1 ng/mlDNA1.00174.9 ng/ml3蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑的反應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，但是不是很明顯。4. 本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果雖然都出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，但是導(dǎo)致得到的物質(zhì)的收率不是很高有以下幾個(gè)原因：a) RNA的得率：樣品勻漿時(shí)實(shí)際量太少，只是樣品裂解不夠徹底，RNA沉淀沒(méi)有完全溶解，還有一些污染等原因?qū)е?RNA降解。b) DNA蛋白質(zhì)得率：樣品的勻漿和裂解的不徹底，得到的沉淀沒(méi)有很好溶解，再就是得到的組織沒(méi)有馬上處理導(dǎo)致樣品的降解。我們只有嚴(yán)格的按照試驗(yàn)的流程操作，從操作步驟，樣品和儀器的準(zhǔn)備，以及

11、注意一 些操作環(huán)境的維護(hù)的事項(xiàng)，這樣才能夠得到欲想要的大分子，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)五 流式細(xì)胞儀凋亡分析AnnexinV/7-ADD雙染色法實(shí)驗(yàn)原理：在凋亡的早期階段，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子快速持續(xù)上升，使谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶被激活，造成胞質(zhì)磷脂不對(duì)稱喪失， 導(dǎo)致膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞內(nèi)層暴漏與外層，Annexin - V為3 5 3 6 KD的鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，并可被F ITC熒光物 指標(biāo)記，故AnnexlnV被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)記之一，7ADD是一種核酸染料，不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡晚期和壞死的細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞膜受到破壞， 而使細(xì)胞核染色。實(shí)驗(yàn)步驟：1樣品處理：2ml（濃度為

12、1X 106 /ml）細(xì)胞接種于6孔板/培養(yǎng)皿 培養(yǎng)24h后，加入合適凋 亡誘導(dǎo)劑，設(shè)置空白對(duì)照1孔，加入同濃度藥物各 3孔（實(shí)驗(yàn)組）2進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)刺激 24h,收集并用PBS洗滌，計(jì)數(shù)，離心3制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸重于 200ul的1 x bin di ng buffer中，每個(gè)樣本濃度約為1 x106 /ml4.100ul制備好細(xì)胞懸液加入到12mm x 75mm試管5加入5ul Annexin - V與7ADD于制備好細(xì)胞懸液中，混勻，室溫孵育5mi n,力口入400ul稀釋后的binding buffer，1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)6. 測(cè)定要做3管對(duì)照1單純細(xì)胞樣本2細(xì)胞樣本只加入

13、5ul Annexin - V3細(xì)胞樣本只加入 1ul 7ADD7. 細(xì)胞儀測(cè)定:525nm測(cè)F ITC ，675nm測(cè)7ADD，分析凋亡細(xì)胞、活細(xì)胞和壞死細(xì) 胞百分率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析APOP 001翼口小口 nn d&：200400 GOO 000 1000Scatter耳匸 KJ®cppw1.這是沒(méi)有做過(guò)藥物處理的細(xì)胞，所以細(xì)胞落在左下象限，還有部分落在右上象限的是死細(xì)胞。3 I I il-.a I T- I r I rAI*1 1/103 IO4AMNEXIN V PE2.這是經(jīng)過(guò)藥物處理的細(xì)胞，可以看到在右下象限出現(xiàn)熒光標(biāo)記，說(shuō)明細(xì)胞處于凋亡早期APOP.002APO

14、P 002Fowaid ScattfiRJiQs遇OO10ANNEXIN V PF3.在左上象限出現(xiàn)標(biāo)記，說(shuō)明藥物處理的細(xì)胞處于凋亡中、晚期或是壞死細(xì)胞。HuIrp一了APOP.003200400600 BOOFnrwgrd ScattpF1000站4Bfc _Xu口r-ri r r* t mh ( Emr*APOP .003w1 w2 io3 w4 ANNFKUN V-PE4.這個(gè)圖片比較全面，各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞特征都能夠體現(xiàn)岀來(lái)02004006008001000Forward ScalierAPOP.OIO10ANNEXIN V-FE1?02004006008001000Forward ScatterAPOP. 004APOP