常規(guī)微生物學(xué)試驗

1、常規(guī)微生物學(xué)試驗曾 占 壯 消毒與滅菌 病原菌的分離、純化與保存 細菌鑒定 細菌的藥物敏感性試驗消毒與滅菌一、概念1. 消毒：是指殺死或消除所有病原微生物的措施，可達到防止疾病傳播的目的。例如將物體煮沸（100）10分鐘或60-70加熱處理30分鐘，就可殺死病原菌的營養(yǎng)體，但絕非殺死所有的芽孢，常用于牛奶、食品以及某些物體表面的消毒。利用具有消毒作用的化學(xué)劑（又叫消毒劑，disinfectant），也可進行皮膚、體膜或體內(nèi)的處理。2. 滅菌：是指用物理或化學(xué)因子，使存在于物體中的所有生活微生物，永久性地喪失其生活力，包括最耐熱的細菌芽孢。這是一種徹底的殺菌措施。通過滅菌的物品不再存在任何有生命

2、的有機體。 二、常規(guī)滅菌方法（一）加熱法干熱滅菌（1）火焰灼燒滅菌：適用于接種環(huán)、接種針及金屬用具、無菌操作時的試管口和瓶口的滅菌。（2）熱空氣滅菌：即通常所說的干熱滅菌，是在電烤箱內(nèi)利用高溫干燥空氣進行滅菌，適用于玻璃器皿的滅菌。濕熱滅菌（1）高壓蒸汽滅菌：將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在一定壓力的環(huán)境下經(jīng)過一定的時間的滅菌方法。滅菌壓力的大小和時間的長短可根據(jù)滅菌物品的種類和數(shù)量的不同而有所變化。此法適用于培養(yǎng)基、工作服、玻璃器皿等的滅菌。（2）常壓蒸汽滅菌：在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下，常壓蒸汽是一種常用的滅菌方法。對于不易用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等

3、可采用此法滅菌。由于壓力為常壓，其溫度不超過100，僅能使大多數(shù)微生物被殺死，而產(chǎn)芽孢細菌卻不能在短時間內(nèi)被殺死，因此可采用間歇滅菌的方法以殺死芽孢細菌，達到徹底滅菌的目的。（3）煮沸消毒法：注射器和解剖器械等可采用此法。一般煮沸時間為1015min，可以殺死細菌所有營養(yǎng)細胞和部分芽孢。如延長煮沸時間，并在水中加入1%碳酸氫鈉或2%5%石炭酸，效果更好。（4）超高溫殺菌：是指在溫度和時間標(biāo)準(zhǔn)分別為135150和28s的條件下對牛乳或其他液態(tài)食品進行處理的一種工藝，其最大優(yōu)點是既能殺死產(chǎn)品中的微生物，又能較好地保持食品品質(zhì)與營養(yǎng)價值。此法的原理是建立在食品品質(zhì)及營養(yǎng)成分等，不遭受熱力破壞的溫度與

4、微生物受熱死亡的溫度兩者之間差異很大的規(guī)律上的。（二）過濾除菌1. 應(yīng)用于血清、抗生素、糖溶液等易受熱破壞的物質(zhì)的滅菌。2. 過濾器蔡氏過濾器：據(jù)其孔徑大小可分為三種型號。（1）k型孔徑最大，作一般澄清用；（2）EK型濾孔較小，用以一般細菌的濾除；（3）EK-S型濾孔最小，可阻止大的病毒通過，使用時可根據(jù)需要選用。微孔濾膜過濾器：最常用的過濾器，其濾膜為醋酸纖維酯和硝酸纖維酯的混合物制成的薄膜，孔徑分0.025，0.05，0.10，0.20，0.22，0.30，0.45，0.60，0.65，0.80，1.00，2.00，3.00，5.00，7.00，8.00和10.00m，實驗室中用于除菌的微

5、孔濾膜孔徑一般為0.22 m，但若欲濾除病毒，則需更小孔徑的微孔濾膜。（三）輻射滅菌 紫外線滅菌：在微生物工作及生產(chǎn)實踐中應(yīng)用較廣。無菌室或無菌接種箱或超凈工作臺的空氣或臺面可采用此法滅菌。 60Co射線滅菌：廣泛應(yīng)用于不能進行加熱滅菌的紙、塑料薄膜、各種積層材料制作的容器以及醫(yī)用生物敷料皮等的滅菌。此法的優(yōu)點為穿透力強，可在厚包裝完好的條件下滅菌。（四）化學(xué)藥品滅菌 化學(xué)藥品消毒滅菌法是應(yīng)用能抑制或殺死微生物的化學(xué)制劑進行消毒滅菌的方法。能破壞細菌代謝機能并有致死作用的化學(xué)藥劑為殺菌劑；只是抑制細菌代謝機能，使細菌不能增殖的化學(xué)藥劑為抑菌劑?；瘜W(xué)藥品對微生物的作用是殺菌還是以軍以及作用效果還

6、與化學(xué)藥品濃度的高低、處理微生物時間的長短、微生物的種類以及微生物所處的環(huán)境等有關(guān)。三、自動立式壓力蒸汽滅菌器操作規(guī)程1.放入待滅菌物品：把滅菌物品予以妥善包扎，各包之間留有間隙，保障其氣路暢通；2.接通電源；3.加水：把生活用水從滅菌桶與蒸鍋夾縫內(nèi)加入至高水位燈亮；4.設(shè)定滅菌溫度：按動控制面板上增加鍵或減少鍵，在綠色數(shù)顯上設(shè)定所需溫度，按動移位鍵進行移位設(shè)定，當(dāng)每次設(shè)定所需溫度結(jié)束時，按確認(rèn)鍵確認(rèn)，即可完成設(shè)定；5.設(shè)定滅菌時間：溫度設(shè)定完畢且確認(rèn)后，綠色溫度數(shù)顯狀態(tài)自動切換成時間狀態(tài)，再用增鍵或減鍵 ，設(shè)定所需的滅菌時間，設(shè)定完畢后，按確認(rèn)鍵確認(rèn)；6.密封：堆放與開機程序設(shè)定完成后，將壓

7、板推入固定柱內(nèi)，應(yīng)注意壓板必須全部推到固定柱內(nèi)，然后將手輪向右旋緊，使蓋與主體密合；7.滅菌：關(guān)閉放氣閥及下排氣閥，當(dāng)壓力表指針升至0.05Mpa時，開啟放氣閥排氣至壓力表指針回復(fù)0位，關(guān)閉放氣閥，當(dāng)壓力表指針升至0.10.15Mpa之間后, 開啟下排氣閥讓微量的蒸汽通過下排氣閥在整個滅菌過程中不斷排出；8.滅菌物品取出：滅菌結(jié)束時，必須先將電源切斷，停止加熱待其冷卻，直至壓力表指針回復(fù)至零位，打開放氣閥排去余氣，才能將蓋開啟。病原菌的分離、純化與保存一、病原菌的分離 選取具有典型癥狀的病體或病灶組織，對于體表或鰓，先經(jīng)無菌水洗滌后用接種環(huán)挑取少量組織；對體內(nèi)組織、器官，先用酒精將病魚胸腹部進

8、行大面積消毒，再經(jīng)無菌水洗滌后，在無菌條件下，從肛門附近剪開一個缺口，沿腹部左側(cè)和右側(cè)向上剪去胸腹壁暴露臟器，以70的酒精藥棉消毒臟器并經(jīng)無菌水洗滌后，接種環(huán)穿刺挑取少量組織。然后劃線接種于預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上， 2537培養(yǎng)2448小時，選取形狀和色澤一致的優(yōu)勢單個菌落，重復(fù)劃線分離培養(yǎng)以獲得純種。接種用具 包括接種環(huán)和接種針，由環(huán)（針）、金屬柄和絕緣材料三部分組成。制作接種環(huán)（針）的材料要求硬度適宜、易于傳熱，火焰灼燒后能較快冷卻，以鉑絲最佳，但因其價格昂貴，現(xiàn)多用鎳鉻絲。環(huán)的直徑為24mm，長58cm。操作環(huán)境1. 無菌室 是實驗室內(nèi)部安裝的用于無菌操作的工作室，一般需安裝兩道以上的門，

9、內(nèi)外室均有紫外線殺菌燈、照明燈，內(nèi)室（即操作室）還要有電源插座。本實驗室無菌室操作流程：開紫外燈滅菌1015min人員進入一更換鞋進入二更更換衣服進入操作室進行相關(guān)試驗操作2. 超凈工作臺 通過空氣過濾裝置使工作臺內(nèi)部保持無菌狀態(tài)。超凈工作臺的濾網(wǎng)（初效過濾器）應(yīng)定期清洗，清洗周期一般為個月培養(yǎng)設(shè)備1. 電熱恒溫培養(yǎng)箱：用于培養(yǎng)普通需氧或兼性厭氧菌。溫控范圍在室溫以上，無致冷作用。2. 生化培養(yǎng)箱：用于培養(yǎng)普通需氧或兼性厭氧菌。溫控范圍廣，有致冷作用，能將培養(yǎng)溫度設(shè)置在室溫以下。3. CO2培養(yǎng)箱：用于分離培養(yǎng)生長時需CO2的細菌，如嗜血桿菌和奈瑟氏球菌等。4. 厭氧袋、厭氧罐和厭氧手套箱：用

10、于分離培養(yǎng)厭氧菌。5. 搖床和振蕩培養(yǎng)箱：用于液體培養(yǎng)。病原菌的分離方法1. 平板連續(xù)劃線分離法 此法適用于含菌數(shù)量較少的樣品。 接種時，先將樣品涂于瓊脂平板的一角，然后用接種環(huán)自樣品涂布部位開始，連續(xù)劃成若干條分散的平行線。2. 平板分區(qū)劃線分離法此法適用于含菌量較多的樣品。（1）用接種環(huán)先將樣品涂布在平板第一區(qū)并作數(shù)次劃線；（2）接種環(huán)灼燒并冷卻后依次在第二、三、四區(qū)作數(shù)次劃線；（3）每一區(qū)域的劃線應(yīng)接觸上一區(qū)域的接種線35次，使菌量逐漸減少，以利出現(xiàn)單個菌落；（4）接種環(huán)的灼燒次數(shù)依樣品的含菌量而定，并非每劃一區(qū)都需灼燒。3. 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法此法主要用于含菌量較少的樣品的增菌培養(yǎng)。（1

11、）用滅菌接種環(huán)挑取少量樣品；（2）在試管內(nèi)壁與液面交界處輕輕研磨，使樣品混勻在液體培養(yǎng)基中。二、細菌的純化純化：微生物學(xué)中將在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群體稱為培養(yǎng)物，而只有一種微生物的培養(yǎng)物稱為純培養(yǎng)（物）。獲得微生物純培養(yǎng)的過程即為純化。純化是分離的延續(xù)。微生物純化方法：同分離方法。三、菌種的保藏（一）菌種保藏的原理 菌種保藏的具體方法很多，原理卻大同小異。首先要挑選典型菌株的優(yōu)良純種，最好采用它們的休眠體（如分生孢子、芽孢等）；其次，還要創(chuàng)造一個適合其長期休眠的環(huán)境條件，諸如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護劑或酸度中和劑等。 一種良好的保藏方法，首先應(yīng)能保持原菌的

12、優(yōu)良性狀不變，同時還須考慮方法的通用性和操作的簡便性。（二）菌種保藏的常用方法1. 傳代培養(yǎng)保藏法又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細菌用）。斜面保藏法是一種最基本的方法，適用范圍廣，細菌、真菌及放線菌都可應(yīng)用。當(dāng)微生物在適宜的斜面培養(yǎng)基和溫度條件下生長良好后，保存在46的冰箱， 一定時間后重新移種一次。一般菌種可保藏36個月。當(dāng)然 保藏溫度和時間都不是絕對的，個別菌種甚至在37保藏為宜， 也有的需要12周傳代一次。這種方法的優(yōu)點是操作簡單， 使用方便，不需特殊設(shè)備，能隨時檢查所保藏的菌株是否死 亡、變異與污染雜菌等；弊端是傳代次數(shù)多了容易發(fā)生變異，如毒力減小、基因失落等

13、，傳代次數(shù)多也容易使污染機會增加。2. 液體石蠟覆蓋保藏法是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當(dāng)延長保藏時間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。主要適用于霉菌、酵母菌、放線菌、需氧性細菌等的保存。3. 載體保藏法是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進行干燥的保藏法。1）土壤保存法：主要用于形成孢子回孢囊的微生物的保存，特別適用于真菌和放線菌不改變性狀的長期保存。2）砂土保存法：常用于梭狀芽孢桿菌和一部分霉菌的保存，可保存數(shù)年。3）硅膠保存法：本法對保存鏈孢霉菌較有效,對酵母菌的

14、保存也較有效。4）磁珠保存法：用本法保存根瘤菌在室溫下至少可保存2年半。5）濾紙保存法：適用于對干燥抵抗力較強的微生物，如產(chǎn)芽孢細菌和葡萄球菌，另外噬菌體、放線菌和絲狀菌也可用本法。4. 懸液保存法1）蒸溜水保存法：霉菌、酵母菌和放線菌的大部分，使其懸浮于蒸餾水中，可在室溫下保存數(shù)年，青枯病假單孢桿菌也可用本法。2）糖液保存法：過去用于保存酵母菌，但現(xiàn)在已不常用。3）其他懸液保存法：如乳鏈球菌可用PBS保存，放線菌可用0.125%稀瓊脂液保存。5. 寄主保藏法用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生

15、物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進行保藏。6. 冷凍保藏法可分低溫冰箱（-20-30，-50-80）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70）和液氮（-196）等保藏法。7. 冷凍干燥保藏法使微生物在冷凍狀態(tài)下，在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水份（真空干燥），使細胞的生理活動事實上停止，從而長期維持生活狀態(tài)，本法適用于大多數(shù)細菌和放線菌，另外病毒、噬菌體、立克次氏體、霉菌和酵母菌在多數(shù)情況下用本法保存。其操作流程為：安瓿管 打印標(biāo)簽 菌 種 配制保護劑 酸洗（2%HCL） 培 養(yǎng) 分 裝 水 洗 制備懸液 滅 菌 蒸餾水洗 分裝安瓿管 或 放離心式凍干裝置的 烘干（或曬

16、干） 安瓿管 離心架上 加標(biāo)簽 預(yù) 凍 開動離心機 塞棉塞 開真空泵 開動真空泵 高壓滅菌 真空干燥 真空度達0.2-0.1毫米 汞柱關(guān)閉離心機 關(guān)閉真空泵 關(guān)閉真空泵 (緩慢通入空氣) 緩慢通入空氣 將安瓿管 取出安瓿管并拉成細頸 拉成細頸 裝多歧管 裝二次干燥器多歧管上 上抽真空 在真空下密封 密 封 檢查真空 保 藏 檢查真空 細菌的鑒定一、細菌鑒定的一般原則和方法（一）重要的參考文獻伯杰細菌鑒定手冊（Bereys Manual of Systematic Bacteriology ）常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊（東秀珠、蔡妙英等）臨床微生物學(xué)手冊（Manual of Clinical Micr

17、obiology，MCM） （二）菌株鑒定的原則及基本方法1. 必須用純的細菌培養(yǎng)物作鑒定。菌種純化至菌落形態(tài)和菌體形態(tài)一致時，才能進行鑒定。2. 對菌株的鑒定通常并不是完全按照檢索表的順序進行的，而是根據(jù)幾個突出的特性，判斷未知菌屬于哪一群菌，然后在這一群菌范圍內(nèi)進行鑒定。臨床細菌鑒定是從科開始的，以下按屬、種做鑒定。3. 選擇適當(dāng)?shù)蔫b定試驗，并不是試驗做的越多越好。因此，注意以下三點：（1）選擇有價值的試驗； （2）快速簡便的試驗； （3）選擇敏感的試驗方法。 二、臨床上常見菌分到科（群）水平的雙歧索引革蘭氏染色+ + 球菌 + 球菌 + H2O2 + 動力 + DNA酶 + 發(fā)酵 葡 鏈

18、 李 棒 卡 奈 +氧化酶 非萄 球 斯 狀 他 氏 發(fā)球 菌 特 菌 布 菌 弧 腸 酵菌 科 菌 屬 蘭 菌 菌 菌科 屬 等 漢 科 科 群（一）菌落形態(tài)的描述 不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般具有穩(wěn)定的特征，可以成為對微生物進行分類、鑒定的重要依據(jù)。根據(jù)菌落的形態(tài)大小、隆起形狀、邊緣形狀等特征可對不同菌落進行描述并加以區(qū)分。（二）革蘭氏染色 革蘭氏染色法是最常用的鑒別染色法之一，可將細菌區(qū)分為革蘭氏陽性、革蘭氏陰性兩大類。染色后細菌能保留結(jié)晶紫而呈藍紫色者，為革蘭氏陽性菌(可寫作G+)，細菌被酒精脫出紫色染料而被復(fù)紅或沙黃染成紅色者，為革蘭氏陰性(可寫作G-)。分類學(xué)上

19、屬于同一科的細菌革蘭氏染色反應(yīng)相同，如芽孢桿菌科細菌全是革蘭氏陽性；腸桿菌科細菌全是革蘭氏陰性。1. 原理 革蘭氏染色法基本原理是：細菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈 現(xiàn)藍紫色；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶解，細胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。2

20、. 操作步驟（1）涂片 挑取培養(yǎng)1624小時的幼齡待檢菌涂片，自然干燥后通過酒精燈火焰12次固定，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。（2）初染 加草酸銨結(jié)晶紫染液一滴，約一分鐘，水洗。（3）媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。（4）脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約2030秒鐘，立即用水沖凈酒精。（5）復(fù)染 用番紅染液染12分鐘，水洗。（6）鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈藍紫色。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細菌，常常呈假陽性。3. 注意事項 革蘭氏染色的結(jié)果與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及操

21、作技術(shù)等有著密切關(guān)系。如涂片太厚或酒精脫色時間太短，革蘭氏陰性菌則可染成革蘭氏陽性菌。酒精脫色時間若太長，革蘭氏陽性菌又會染成革蘭氏陰性菌。在缺乏鎂鹽的培養(yǎng)基中，革蘭氏陽性菌可變?yōu)楦锾m氏陰性菌。菌齡也能影響染色的結(jié)果，這和生長過程中核酸含量的改變有關(guān)，例如本是革蘭氏陽性菌的老齡菌因核酸的減少則常出現(xiàn)許多革蘭氏陰性菌的細胞。 對未知菌進行革蘭氏染色時，應(yīng)用已知的革蘭氏陰、陽性菌作陰、陽性對照，以確證染色操作正確，結(jié)果可靠。三、細菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)（一）酶類試驗1. 氧化酶試驗 氧化酶即細胞色素氧化酶，也稱呼吸酶。氧化酶在有分子氧和細胞色素C存在時，可氧化鹽酸二甲基對苯撐二胺或鹽酸四甲基對

22、苯撐二胺，使之呈玫瑰紅到深紫紅色。2. 觸酶（過氧化氫酶）試驗 具有觸酶（過氧化氫酶）的細菌能催化過氧化氫，放出新生態(tài)氧，繼而形成分子氧，出現(xiàn)氣泡。 注意事項：（1）測試菌要新鮮；（2）過氧化氫酶是1種以正鐵血紅素作為輔基的酶，所以測試菌所生長的培養(yǎng)基不可含有血紅素或紅血球，因在這種培養(yǎng)基上生長的菌，易產(chǎn)生假陽性。3. 硝酸鹽還原試驗 某些細菌能把培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨和氮等，在細菌分類鑒定中常常檢查這一特性。當(dāng)培養(yǎng)液中加入格里斯氏（Griess）試劑時，如果培養(yǎng)基中的硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽，則溶液呈粉紅色、玫瑰紅色、橙色、棕色等。但是對不同細菌而言，亞硝酸鹽不一定是硝酸鹽還原的終

23、末產(chǎn)物，有可能是整個還原過程的中間產(chǎn)物，所以格里斯氏試劑判定為陰性的菌株還不能最終判定為硝酸鹽還原陰性，應(yīng)通過進一步的試驗（加入二苯胺試劑或鋅粉）來進行最終判定。加入二苯胺試劑后培養(yǎng)液如呈藍色，則表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽，硝酸鹽未被還原，結(jié)果為陰性；如不呈藍色，表示硝酸鹽和新形成的亞硝酸鹽都已還原成其他物質(zhì)，故仍應(yīng)判讀為硝酸鹽還原陽性。加入鋅粉后培養(yǎng)液如呈紅色，表明硝酸鹽仍存在，判讀為硝酸鹽還原陰性。4. DNA酶試驗 某些細菌可產(chǎn)生細胞外DNA酶。DNA酶可水解DNA長鏈，形成數(shù)個單核苷酸組成的寡核苷酸鏈。長鏈DNA可被酸沉淀，而水解后形成的寡核苷酸則可溶于酸，因此，當(dāng)在菌落平板上加入酸后，若

24、在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)，表示該菌具有DNA酶。（二）碳水化合物的代謝試驗1. 葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗 在細菌鑒定中，糖類發(fā)酵產(chǎn)酸是一項重要依據(jù)。細菌對糖類的利用有兩種類型：一種是從糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，不需要以分子氧作為最終受氫體，稱發(fā)酵型產(chǎn)酸；另一種則以分子氧作為最終受氫體，稱氧化型產(chǎn)酸。前者包括的菌種類型為多數(shù)。氧化型產(chǎn)酸量較少，所產(chǎn)生的酸常常被培養(yǎng)基中的蛋白胨分解時所產(chǎn)生的氨所中和，而不表現(xiàn)產(chǎn)酸。試驗中，氧化型產(chǎn)酸僅開管產(chǎn)酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部產(chǎn)堿(12天)，后來才稍變酸。發(fā)酵型產(chǎn)酸則開管及閉管均產(chǎn)酸，如產(chǎn)氣，則在瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡。2. 糖(醇)類發(fā)酵試驗 不同的細菌含有發(fā)酵不同糖

25、(醇)的酶，因而發(fā)酵糖(醇)的能力各不相同，所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物亦不相同，如有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生可利用指示劑溴甲酚紫pH5.2(黃色)6.8(紫色)來判定，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的杜氏小管中有無氣泡來證明。3. 雙糖鐵瓊脂試驗 用于檢測細菌糖（葡萄糖、乳糖）發(fā)酵及硫化氫反應(yīng)。如細菌分解葡萄糖及乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，斜面與底層（高層）均變?yōu)辄S色，并且培養(yǎng)基中出現(xiàn)氣泡。如細菌分解葡萄糖而不分解乳糖，因產(chǎn)酸量少，細菌利用含氮物質(zhì)產(chǎn)生堿性化合物，使斜面部分又變成紅色，底層（高層）由于缺氧，細菌分解葡萄糖產(chǎn)生的酸未被氧化而仍保持黃色。細菌如分解含硫氨基酸，

26、產(chǎn)生H2S與培養(yǎng)基中的硫酸亞鐵反應(yīng)生成黑色沉淀（硫化亞鐵）。4. -半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗） 某些細菌具有-半乳糖苷酶，可分解鄰-硝基- -半乳糖苷（ONPG），生成黃色的鄰-硝基酚。本試驗可測定不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵乳糖的細菌是否產(chǎn)生此酶，應(yīng)用于腸桿菌科各屬的鑒定。5. 甲基紅(Methylred)試驗(MR試驗) 本試驗用于測定細菌發(fā)酵葡萄糖的變化。很多細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降低到4.2以下，這時若加甲基紅指示劑呈現(xiàn)紅色，為MR陽性。因甲基紅指示劑變色范圍是pH4.4(紅色)pH6.2(黃色)。若某些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，但很

27、快將丙酮酸脫羧，轉(zhuǎn)化成醇等物，則培養(yǎng)基的pH仍在6.2以上，故此時加入甲基紅指示劑呈現(xiàn)黃色，為MR陰性。6.甲基乙酰甲醇試驗（V-P試驗） 同甲基紅試驗相同，本試驗也用于測定細菌發(fā)酵葡萄糖的變化。細菌從葡萄糖產(chǎn)酸，并接著將酸轉(zhuǎn)化為3-羥基-2-丁酮或2，3-丁二醇等中性物質(zhì)，兩種物質(zhì)在堿性環(huán)境下被空氣中的氧氣氧化為二乙酰，它再與蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色化合物，為V-P試驗陽性。（三）蛋白質(zhì)、氨基酸分解試驗1. 靛基質(zhì)（吲哚）試驗 某些細菌能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)（吲哚），靛基質(zhì)與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰色靛基質(zhì)（紅色化合物）。2. 氨基酸脫羧酶試驗 有些細菌

28、含有某種氨基酸脫羧酶，能使該種氨基酸的羧基釋出，生成胺類和二氧化碳，從而使培養(yǎng)基呈堿性反應(yīng)，指示劑變色。 3. 苯丙氨酸脫氨酶試驗 某些細菌具有苯丙氨酸脫氨酶，能將苯丙氨酸氧化脫氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化鐵呈藍綠色。本實驗用于腸桿菌科和某些芽孢桿菌屬的鑒定。4. 尿素酶試驗 某些細菌能產(chǎn)生尿素酶，分解尿素形成氨，使培養(yǎng)基變堿，酚紅指示劑隨之變紅色。5. 硫化氫試驗 某些細菌能分解含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽，形成黑色沉淀硫化鉛或硫化鐵，為硫化氫試驗陽性，可借以鑒別細菌。（四）碳源利用試驗1. 檸檬酸鹽利用試驗 檸檬酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)

29、基，其中檸檬酸鈉為碳的唯一來源。而磷酸二氫銨是氮的唯一來源。有的細菌如產(chǎn)氣桿菌，能利用檸檬酸鈉為碳源，因此能在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長，并分解檸檬酸鹽后產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。此時培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍指示劑由綠色變?yōu)樯钏{色。不能利用檸檬酸鹽為碳源的細菌，在該培養(yǎng)基上不生長，培養(yǎng)基不變色。2. 丙二酸鹽利用試驗 在丙二酸鹽培養(yǎng)基中，細菌能利用的碳源只有丙二酸鹽。當(dāng)某種細菌能利用丙二酸鹽時，可將其分解為NaCO3，使培養(yǎng)基變堿，溴百里酚藍指示劑由淡綠色變?yōu)樗{色。（五）細菌分類鑒定常用指示劑的配制及酸堿（感應(yīng)界限）指示范圍指示劑色調(diào)變更酸堿PH感應(yīng)界限稀釋0.1g指示劑所需的0.1N NaOH(

30、ml)加蒸餾水到下列量(ml)濃 度(%)10ml培養(yǎng)基所需指示劑的量(ml)溴酚藍黃藍3.04.61.492500.040.5溴甲酚紫黃紫5.26.81.852500.040.5溴百里酚藍黃藍6.07.61.602500.040.5甲基紅紅黃4.46.05000.020.2酚紅紅黃6.88.42.825000.020.5麝香草酚藍（堿）黃藍8.09.62.152500.040.252細菌的藥物敏感性試驗一、藥敏試驗的主要方法 細菌對抗菌藥物的敏感試驗（簡稱藥敏試驗）常用的方法有兩種：瓊脂擴散法；稀釋法（瓊脂稀釋法、試管稀釋法、微量稀釋法）。二、瓊脂擴散法 瓊脂擴散法為定性測定細菌的藥物敏感性。目前以WHO推薦的Kirby-Bauer紙片擴散法（簡稱KB法）作為常規(guī)使用，并應(yīng)用Nccls（美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會）推薦的標(biāo)準(zhǔn)進行評價。（一） KB法基本原理 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種待檢菌的瓊脂平板上，紙片中所