微生物限度檢查方法驗證方案(共7頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上微生物限度檢查方法驗證方案六、驗證內(nèi)容 1.供試液的制備 1.1.取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，充分振搖使混勻，作為1:10的供試液。 1.2.取1:10供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，充分振搖使混勻，作為1:100的供試液。 1.3.取1:100供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，充分振搖使混勻，作為1:1000的供試液。    備注：供試液制備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不超過45。供試液從

2、制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時。     2.菌液制備 2.1.接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng) 物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824小時；分別取上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，依次稀釋至、制成每1ml含菌數(shù)為小于100cfu的菌懸液。 2.2.接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，2025培養(yǎng)23 天；取此培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，依次稀釋至，制成每1m

3、l含菌數(shù)為小于100cfu的菌懸液。  2.3.將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)57天，使大量的孢子成熟。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液依次稀釋至，制成每 1ml 含孢子數(shù)小于100cfu 的孢子懸液。  2.4.上述菌懸液制備后若在室溫下放置，應在

4、2小時之內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗證過的貯存有效期內(nèi)使用。3.計數(shù)方法的驗證 3.1.需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)（平皿法）   所加菌液的體積不得超過供試液體積的1%。為確認供試品中的微生物能被充分 檢出，首先應選擇最低稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性檢查。 3.1.1.試驗組   取上述制備好的供試液，加入試驗菌液、混勻，使每1ml供試液或每張濾膜過濾 的供試液中含菌量不大于100cfu。 取的供試液9.9ml和小于10000cfu的銅綠

5、假單胞菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基 1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點計菌落數(shù)。平行制備2個平皿。 取的供試液9.9ml和小于10000cfu的金黃色葡萄球菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點計菌落數(shù)。平行制備2個平皿。 取的供試液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽孢桿菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點計菌落數(shù)。平行

6、制備2個平皿。 取的供試液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點計菌落數(shù)。平行制備2個平皿。 取的供試液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點計菌落數(shù)。平行制備2個平皿。 取的供試液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基1520ml，

7、混勻，凝固，于2025倒置培養(yǎng)5天點計菌落數(shù)。平行制備2個平皿。 取的供試液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于2025倒置培養(yǎng)5天點計菌落數(shù)。平行制備2個平皿。     3.1.2.菌液組 取小于100cfu的銅綠假單胞菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液、枯草芽孢桿菌菌懸液、白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌懸液各1ml，注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基約1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點計菌落數(shù)。各平行制

8、備2個平皿。 取小于100cfu的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌懸液各1ml，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基各1520ml，混勻，凝固，于2025倒置培養(yǎng)5天點計菌落數(shù)。各平行制備2個平皿。 3.1.3.供試品對照組 取的供試液1ml，注入平皿中，分別立即傾注1520 ml溫度不超過45胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基3035倒置培養(yǎng)3天點計菌落數(shù)，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基2025倒置培養(yǎng)5天點計菌落數(shù)。各組平行制備2個平皿。     3.1.4.結果判斷 3.

9、1.4.1計算公式： 稀釋劑對照組菌數(shù)的回收率=（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)供試品對照組的平均菌落數(shù)）/菌液組的平均菌落數(shù) 試驗組菌數(shù)的回收率=（試驗組的平均菌落數(shù)供試品對照組的平均菌落數(shù)）/菌液組的平均菌落數(shù)  3.1.4.2判定標準： 實驗組、稀釋劑對照組（如有）的菌數(shù)回收率應在0.52之間。若各試驗菌的回收 率均符合規(guī)定，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧菌總數(shù)、 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。   3.1.5試驗結果  供試品批號、。菌種類型試驗次數(shù)菌液組實驗組供試品對照組回收率銅

10、綠假單胞菌1平均2平均3平均金黃色葡萄球菌1平均2平均3平均枯草芽孢桿菌1平均2平均3平均白色念珠菌（需氧菌驗證）1平均2平均3平均黑曲霉（需氧菌驗證）1平均2平均3平均白色念珠菌（霉菌、酵母菌驗證）1平均2平均3平均黑曲霉（霉菌、酵母菌驗證）1平均2平均3平均結果判定：   驗證人： 復核人：日期：  日期：4.控制菌檢查 4.1.（大腸埃希菌）的驗證 4.1.1.試驗組 取的供試液ml（取相當于1g或1ml供試品的供試液），小于100cfu的大腸埃希菌菌懸液1ml，加至約100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，于3035培養(yǎng)1

11、824小時。 4.1.2.陰性對照組 取pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液10ml，加至約100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，于3035培養(yǎng)1824小時。 4.1.3.陽性對照組 取小于100cfu的大腸埃希菌菌懸液1ml，加至約100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，于3035培養(yǎng)1824小時。 4.1.4.檢查 取上述培養(yǎng)物1ml，接種至含100ml 麥康凱液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，4244培養(yǎng)2448小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上3035培養(yǎng)1872小時。 檢查結果如下： 第一次試驗結果：

12、0;   供試品批號：序號步驟實驗組陽性對照組 陰性對照組1胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，3035培養(yǎng)1824小時 2麥康凱液體培養(yǎng)基，4244培養(yǎng)2448小時3取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，3035培養(yǎng)1872小時若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗, 確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判未檢出大腸埃希菌。4分離純化、染色鏡檢、生化試驗等結果：第二次試驗結果：    供試品批號：序號步驟實驗組陽性對照組 陰性對照組1胰酪大豆胨

13、液體培養(yǎng)基，3035培養(yǎng)1824小時 2麥康凱液體培養(yǎng)基，4244培養(yǎng)2448小時3取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，3035培養(yǎng)1872小時若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗, 確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判未檢出大腸埃希菌。4分離純化、染色鏡檢、生化試驗等結果：第三次試驗結果：    供試品批號：序號步驟實驗組陽性對照組 陰性對照組1胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，3035培養(yǎng)1824小時 2麥康凱液體培養(yǎng)基，4244培養(yǎng)2448小時3取麥康凱液體培養(yǎng)

14、物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，3035培養(yǎng)1872小時若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗, 確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判未檢出大腸埃希菌。4分離純化、染色鏡檢、生化試驗等結果：標準：陽性對照和試驗組應檢出大腸埃希菌，陰性對照應無菌生長。 結果判定：驗證人： 復核人：日期： 日期：備注：采用以上供試液制備方法，分別對需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)和控制菌檢查法進行方法驗證時，若結果不能達到各標準時，應繼續(xù)采用其他方法（如培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法等）消除供試品的抑菌活性，重新進行方法驗證。七、驗證異常情況處理  本次驗證實施人員異動情況：  發(fā)生變化    未發(fā)生變化  ，發(fā)生異動情況描述如下：   本次驗證測試儀器校驗情況：  符合要求    不