胡蘿卜組織培養(yǎng)系統(tǒng)試驗(yàn)

1、云南大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)院系：生命科學(xué)學(xué)院年級(jí)專業(yè)：2013級(jí)生物技術(shù)（國家生命科學(xué)與技術(shù)姓名：楊夢(mèng)梅選課號(hào)：學(xué)號(hào)：座號(hào)：A2開課日期：2015.09學(xué)期：2015秋季學(xué)期任課教師：呂琦、牛蕓云南大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 制胡蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究第一作者：楊夢(mèng)梅 同組實(shí)驗(yàn)者：趙姍（云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650504）摘要:以胡蘿卜肉質(zhì)根為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織，并建立細(xì)胞懸浮系實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:胡蘿卜肉質(zhì)根是誘導(dǎo)愈傷組織和進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的可行外植體；誘導(dǎo)致密型愈傷組織的最佳激素濃度配比是0.5 mg/ L 2, 4- D+0.4 mg/

2、L KT; 繼代培養(yǎng)1代2時(shí)，可得到高活性的懸浮細(xì)胞系；細(xì)胞懸 浮培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過14天達(dá)到高峰期（生長平臺(tái)）。關(guān)鍵詞:胡蘿卜；組織培養(yǎng)；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；致密型愈傷組織；The study about inducement, subculture and suspension celllines of Carrots ' callusAbstract : Carrots ' flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental

3、 results show that: Carrots ' flesh roots really can induce callus and then makesuspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high

4、activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth.Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in highden sity胡蘿卜(Daucus carota L .),屬于十字花科植物，是一種十分重要的蔬菜作物，由于胡蘿卜肉質(zhì)根營養(yǎng)豐富，約含有88%的水、6%8%糖、1%2%植物纖維，0. 7%1. 2%蛋白質(zhì)、1%灰份及03%脂肪，及其適于生食、加工、 烹調(diào)等多種用途，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。中國是農(nóng)業(yè)大國，胡

5、蘿卜作為蔬菜作物在人們生活中起著重要的作用。因此，加快我國胡蘿卜育種研究以成為迫切需要。近些年來，隨著生物技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，作為生物技術(shù)研究的理想材料，許多國家對(duì)胡蘿卜體細(xì)胞雜交技術(shù)、遺傳轉(zhuǎn)化與再生技術(shù)、分子標(biāo) 記與基因克隆技術(shù)進(jìn)行了廣泛深入的研究。我國科研工作者在胡蘿卜的生物技術(shù) 與分子生物學(xué)研究上也取得了一定進(jìn)展，特別是在組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體融合 、 遺傳轉(zhuǎn)化及再生等方面。但是在胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)方面并不是太多，因此繼續(xù)深入研究還是很有必要的。本文對(duì)胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的條件進(jìn)行探討，為其次生代謝產(chǎn)物a -胡蘿卜素、B -胡蘿卜素(維生素 A前體)的生產(chǎn)以及

6、將 來的工廠化和分子生物學(xué)研究打下基礎(chǔ)。1材料和方法1. 1材料來源胡蘿卜肉質(zhì)根自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購買1.2方法1.2. 1 MS培養(yǎng)基 的配制1000ml1）用大燒杯取蒸餾水100-120ml2）依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量鈣鹽（10x）、 10ml 微量 I （100x）、1ml 微量 II（ 1000x）、10ml 鐵鹽（100x）、10ml 有機(jī)（100x）、100ml有機(jī)肌醇（10x）、以及適當(dāng)含量植物激素。3）稱取30g蔗糖加入，攪拌直至全部溶解，作為1號(hào)溶液備用。4）稱取9g瓊脂，用量筒量取500ml蒸餾水一起加入1000ml體積白瓷缸中，放在電爐上

7、一邊加熱一邊攪拌，加熱直至清澈無沉淀。將1號(hào)溶液加入，繼續(xù)加熱攪拌，至將要沸騰，離火。5）用pH試紙調(diào)pH至5.8-6.0。6）在白瓷缸中定容至1000ml，攪拌均勻。7）分裝至350ml培養(yǎng)瓶中每瓶約 4050ml。 121 C高壓滅菌20min。探究實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)基代號(hào)基本培養(yǎng)基2， 4-D mg/LKT?mg/LM1MS無無M2MS1 I無M3MS20.5M4MS無11.2. 2胡蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo)（1）以胡蘿卜肉質(zhì)根形成層為外植體誘導(dǎo)。用自來水洗凈胡蘿卜肉質(zhì)根，用小刀切成長約67cm塊段，將其在75%的酒精中消毒60s,再用0. 1%的升汞消毒 10min 或用 20%次氯酸鈉水溶 液消毒

8、 20min, 最 后用無菌水漂洗三遍每遍 510min.(2) 消毒好的胡蘿卜根塊,切去形態(tài)學(xué)下端的510mm厚的一片,留下部分用消 毒好的小刀 , 沿截面橫切成厚度 35mm 左右的小圓片 , 然后將小圓片的韌皮部 和木質(zhì)部切去 , 留下形成層 , 再切成長 3mm, 寬 1. 5mm, 高 35mm 的小長塊 , 分別接種在 Ml M2 M3 M4的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上.( 3)獲得愈傷后進(jìn)行繼代培養(yǎng) , 培養(yǎng)環(huán)境條件與誘導(dǎo)培養(yǎng)相同 .1. 2. 3 胡蘿卜愈傷組織的繼代( 1)從培養(yǎng)瓶中取出愈傷組織，置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用解剖刀將愈傷組織壞死部 分剔除并將愈傷組織切成黃豆大小顆粒，放在無激素的新

9、鮮培養(yǎng)基表面，用鑷子 輕輕壓實(shí)，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種 23個(gè)切塊。用記號(hào)筆標(biāo)注操作者、組別和日期。( 2) 34周后在相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng) 1 次。1. 2. 4 胡蘿卜細(xì)胞無菌系的建立懸浮培養(yǎng)(1) 用鑷子夾取在固體繼代培養(yǎng)基上繼代10d 左右的胚性愈傷組織即分散性好、疏松的愈傷 , 稱取鮮重 2g 左右的胡蘿卜愈傷組織， 在滅過菌的培養(yǎng)皿中用 無菌鑷子盡量將其撥散。(2) 將散碎的愈傷組織轉(zhuǎn)移入盛有20ml液體無激素MS培養(yǎng)基的三角瓶中。(3) 置于80120r/min搖床上25C暗培養(yǎng)。( 4)每隔 3 天換液 1 次，用吸管吸去 3/4 舊培養(yǎng)液，再加入等量新鮮培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng) 2 代 4

10、代后逐漸形成穩(wěn)定的細(xì)胞系。 胡蘿卜愈傷組織的“器官分化”與“體細(xì)胞胚發(fā)生”1)在超凈工作臺(tái)上，用鑷子去除繼代培養(yǎng) 12次的疏松愈傷組織，在無菌載臺(tái) 上分割成長3mm,寬1. 5mm,高35mm的小長塊，去除黑色、灰色或棕色的壞死細(xì)胞部分。(2) 接種在M5 M6培養(yǎng)基上，每瓶13塊，輕輕壓實(shí)，以保證和培養(yǎng)基充分接 觸。(3) 標(biāo)注清楚組別和日期。26 C,光照16h/d，4周后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. 1實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄：我們組負(fù)責(zé)配置的是 M1, M2, M3, M4每種各接種兩瓶?？偨臃N瓶數(shù)8瓶總接種塊數(shù)23塊污染瓶數(shù)3瓶污染塊數(shù)5未污染瓶數(shù)5瓶未污染塊數(shù)18塊未污染塊中愈傷組織發(fā)生塊 數(shù)

11、15愈傷組織發(fā)生率83.33%愈傷組織發(fā)生情況記錄18塊接種成功，其中有11塊愈傷組織的色澤 較新鮮呈近乎白色，7塊顏色偏深黃，渾濁。污染情況及原因分析未成功的3瓶中，污染瓶中，有1瓶是霉菌污 染，分析原因?yàn)榕囵B(yǎng)基內(nèi)水分過多，因此要選擇水分適宜的培養(yǎng)基；1瓶細(xì)菌污染，可能 是接種過程中接種器械消毒不夠， 掀幵圭寸口膜 時(shí)碰到了封口膜里面，也可能是封口膜沒綁 好；一瓶為在接種過程中胡羅卜組織被燙傷，分析原因?yàn)槭中g(shù)刀在灼燒后沒有完全冷卻就使用，導(dǎo)致胡蘿卜切面被燙傷?？偨臃N瓶數(shù)4瓶總接種塊數(shù)11污染瓶數(shù)2污染塊數(shù)5未污染瓶數(shù)2未污染塊數(shù)6未污染塊中愈傷組織發(fā)生塊數(shù)6愈傷組織發(fā)生率100%愈傷組織發(fā)生

12、情況記錄6塊接種成功，其中有4塊愈傷組織 的色澤較新鮮呈淺黃色，2塊顏色偏 深黃，渾濁。污染情況及原因分析兩瓶都是在接種過程中胡蘿卜組織被燙傷，分析原因?yàn)槭中g(shù)刀在灼燒后沒有完全冷卻就使用，導(dǎo)致胡蘿卜切 面被燙傷。2.1.4胡蘿卜細(xì)胞無菌系的建立懸浮培養(yǎng)結(jié)果：（以大組812人統(tǒng)計(jì)結(jié)果）瓶號(hào)接種質(zhì)量g3天后質(zhì)量6天后質(zhì)量14天后質(zhì)平均每天gg量g增值質(zhì)量g11.982.002.733.900.14胡蘿卜愈傷組織的“器官分化”與“體細(xì)胞胚發(fā)生”結(jié)果: 因?qū)嶒?yàn)培養(yǎng)時(shí)間問題，還未觀察到具體結(jié)果。預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：如果愈傷組織脫分化以后進(jìn)行再分化，則應(yīng)當(dāng)先時(shí)愈傷組織下部分化出根，在上部發(fā)育出芽，隨著不斷地生

13、長，最終發(fā)育成完整的植株；如果是體細(xì)胞胚發(fā)生，則可以不經(jīng)過愈傷組織階段就可以發(fā)育為體細(xì)胞胚；但是體細(xì)胞胚比愈傷組織難生成得多，很多植物還無法進(jìn)行體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)生成，體細(xì)胞 胚一旦形成，便可慢慢的分化為完整的植株。與愈傷組織發(fā)生相比，體細(xì)胞胚更 不容易發(fā)生遺傳變異，從而誘導(dǎo)分化發(fā)育成的植株更穩(wěn)定。2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖片第一次培養(yǎng)M1-1 M2-1 M2-2 M4-1 M3-1 培養(yǎng)成功M4-2 霉菌M1-2 細(xì)菌污染M3-2 細(xì)菌污染 燙傷污染情況：接種 8 瓶，污染 3 瓶，5 瓶未污染第二次培養(yǎng)1-2 燙傷2-1 霉菌1-1 愈傷組織2-2 愈傷組織繼代實(shí)驗(yàn)情況因未觀察到，所以未附圖。3. 分

14、析討論：3.1 對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析及其結(jié)論然后再在繼代培養(yǎng)基上可以增殖得到更多更好的愈傷組織。3.2 實(shí)驗(yàn)總結(jié)4. 展望拓展：這次的實(shí)驗(yàn)總體來說還是失敗的，第一次實(shí)驗(yàn)成功率低原因在于在做實(shí)驗(yàn)前 沒有好好了解實(shí)驗(yàn)流程，雖然老師在上課時(shí)做了相應(yīng)的講解，但一些細(xì)節(jié)上的操 作和技巧還是沒有弄明白 , 對(duì)于無菌操作的重要性還是沒有深刻的意識(shí)。 在第二次 實(shí)驗(yàn)中我更加注意了這個(gè)問題，將無菌操作臺(tái)上的物品按最合理的方式放置，既 不影響操作，也方便拿取，操作過程不離實(shí)驗(yàn)臺(tái)，儀器輕拿輕放，盡量不帶起空 氣大幅度流動(dòng)，將酒精燈移到空氣濾膜附近，在整個(gè)過程都在酒精燈旁操作；另 一方面，在以后的實(shí)驗(yàn)中自己一定

15、要提前對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容有所了解，將課件及實(shí)驗(yàn)講義上的知識(shí)吃透 ,理清實(shí)驗(yàn)思路。 這是能做出成功實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ) ,否則, 在老師講解時(shí) 聽不懂 ,自己思路不清晰，這將使我們?cè)谧鰧?shí)驗(yàn)時(shí)的難度加大, 浪費(fèi)做實(shí)驗(yàn)的寶貴時(shí)間，實(shí)驗(yàn)也不易做成功。經(jīng)過這次的測(cè)試技術(shù)實(shí)驗(yàn) ,我個(gè)人得到了不少的收獲 , 一方面加深了我對(duì)課本 理論的認(rèn)識(shí) , 另一方面也提高了實(shí)驗(yàn)操作能力。 這次的實(shí)驗(yàn)跟我們以前做的實(shí)驗(yàn)不 同，因?yàn)檫@次實(shí)驗(yàn)大部分是個(gè)人操作，我覺得這次我是真真正正的自己親自去完 成，所以是我覺得這次實(shí)驗(yàn)最寶貴，最深刻的。比較高興的一點(diǎn)是我的愈傷組織 成活率在同班同學(xué)里還是比較高的，在準(zhǔn)備愈傷組織的擴(kuò)大化培養(yǎng)中，大多數(shù)同 學(xué)用

16、的都是我的材料，心里感到很自豪。在這次的實(shí)驗(yàn)中我也深深體會(huì)到課本上的純理論知識(shí)對(duì)于實(shí)踐的指導(dǎo)作用： 弄懂實(shí)驗(yàn)原理，然后通過實(shí)驗(yàn)的操作的靠自己親自動(dòng)手，親自開動(dòng)腦筋，親自去 請(qǐng)教別人才能得到提高的。臨近期末，非常感謝牛蕓老師和呂琦老師在本學(xué)期給予我們的細(xì)致生動(dòng)的教 學(xué)，也許以后不見得會(huì)再學(xué)習(xí)更多更加專業(yè)的后續(xù)課程，但是它對(duì)于我們拓展專 業(yè)及相關(guān)知識(shí)面、溫習(xí)所學(xué)的細(xì)胞工程內(nèi)容、應(yīng)用理論分析問題、解決問題的方 面體現(xiàn)的思維方式卻讓我受益匪淺。特別是牛蕓老師在指導(dǎo)我實(shí)驗(yàn)操作時(shí)說的那 一句“這樣來控制會(huì)比較省力，可愛的孩子 ! ”謝謝老師的悉心教導(dǎo)，在此，學(xué)生 提前祝福老師新年快樂，身體健康 !參考文獻(xiàn)

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