優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化效率因子分析

1、 優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化效率因子分析劉彩萍 , 曾炳山 , 裘珍飛 , 李湘陽 , 劉 英 (中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所繁育中心 , 廣東廣州 510520摘要 共培養(yǎng)法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因比較常用的方法之一。 建立一個(gè)高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系 , 除了確定抗生素種類 , 菌種和菌液濃度 , 預(yù) 培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)間等基本因子外 , 優(yōu)化影響轉(zhuǎn)化的因子非常重要。 主要介紹和分析共培養(yǎng)法中可能優(yōu)化的影響基因轉(zhuǎn)化因子 , 為提高 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化率提供了方法和依據(jù)。 關(guān)鍵詞 農(nóng)桿菌 ; 預(yù)培養(yǎng) ; 侵染液 ; 接種 ; 共培養(yǎng) 中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611(2010

2、03-01141-03Ana lysis of the O pti m i zed Factors on the Eff ic iency of A grobacterium M ted L IU Ca i 2p i n g et a l (B reeding Center of Trop ical Forestry I nstitute, Abstract Co 2culture is one of the Agrobacterium mediated . choice of antibi otics, Agrobacteri 2um strain and op tical density,

3、 ti m e of the p re 2co 2m transf or mation are als o very i m portant in develop ing an efficient genetic The op oduced in co 2culture method in order to p r ovide methods and basis for or mation . Key words ; I 2fluid; I noculation; Co 2culture基金項(xiàng)目 國家林業(yè)局 “ 948” 引進(jìn)國際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目 (200624270 。作者簡(jiǎn)介 劉彩萍

4、(1980- , 女 , 山西寧武人 , 在讀碩士 , 助理工程師 ,從事桉樹轉(zhuǎn)基因育種研究。收稿日期 2009209223 農(nóng)桿菌 (Agrobacterium 是一種革蘭陰性土壤桿菌 , 具有 天然的基因轉(zhuǎn)移能力。 它可以侵染植物的受傷部位 , 將一段 編碼激素合成酶的 DNA 片段轉(zhuǎn)移到被侵染的植物細(xì)胞基因 組中 , 激素的過量生產(chǎn)導(dǎo)致被侵染的植物細(xì)胞自主生長(zhǎng) , 所 以被科學(xué)家改良作為植物轉(zhuǎn)基因的工具。 用于植物基因轉(zhuǎn) 移的農(nóng)桿菌有兩種類型 , 即含有 Ti 質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tum efaciens 和含有 R i 質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌 (Agrobacter

5、ium rhizogenes 。 在目前的應(yīng)用中 , 主要以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為主1-2。 與其他轉(zhuǎn)基因方法相比 , 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有轉(zhuǎn)化率高、 導(dǎo)入植物細(xì)胞的片段確切 , 且導(dǎo)入的片段 拷貝數(shù)低、 表達(dá)效果好 , 使用的技術(shù)和儀器簡(jiǎn)單 , 是轉(zhuǎn)基因方 法中最普及、 經(jīng)濟(jì)和有效的方法 1。 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行林木基因轉(zhuǎn)化的方法有葉圓片法、 共培養(yǎng)法和直接接種法 , 其中共培養(yǎng)法利用比較普遍3。建立一個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化體系 , 在確定了基本的技術(shù)參數(shù)指標(biāo) 后 , 需要逐步優(yōu)化影響因子 , 從而提高轉(zhuǎn)化效率。 用農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的共培養(yǎng)法來建立遺傳轉(zhuǎn)化體系時(shí) , 一些基本的因子包 括抗生素的確定、 菌種的選擇、

6、 菌液濃度、 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、 泡菌 時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等 , 通過優(yōu)化其中的一些影響因素 , 可以 有效提高轉(zhuǎn)化率 , 起到事半功倍的效果。 筆者主要介紹和分 析共培養(yǎng)法中可能優(yōu)化的基因轉(zhuǎn)化因子 , 為提高農(nóng)桿菌介導(dǎo) 轉(zhuǎn)化率提供方法和依據(jù)。1 預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基的優(yōu)化外植體進(jìn)行共培養(yǎng)前 , 一般都要在含有外源激素的培養(yǎng) 基上預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間 , 目的是使植物組織代謝活躍 , 促進(jìn)細(xì) 胞分裂 , 分裂狀態(tài)的細(xì)胞更易整合外源 DNA, 從而提高外源 基因的瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)化率4-5。 預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基一般是固定的 , 即為適合外植體再生的培養(yǎng)基 , 但是也有人認(rèn)為 , 在預(yù) 培養(yǎng)時(shí)降低鈣的含量會(huì)促進(jìn)農(nóng)桿菌的侵染。

7、鈣在對(duì)致病微 生物抵抗方面起到重要作用 , 而鈣的不足會(huì)引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變 , 這種改變使農(nóng)桿菌更容易附在愈傷上 , 增強(qiáng)農(nóng)桿菌 對(duì)愈傷的感染能力。 蘇文潘等6在農(nóng)桿菌介導(dǎo)橡樹遺傳研究中發(fā)現(xiàn) , 外源鈣的修飾改變了橡膠樹胚胎組織結(jié)構(gòu) , 隨著 外源鈣的增加 , 多糖化合物增多 , 刺激了細(xì)胞的分離。 Mon 2t or o 等7發(fā)現(xiàn) , 橡膠樹愈傷組織在無 CaCl 2培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間后 , 可以提高報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)活性 , 從而提高 轉(zhuǎn)化效率。 Mont or o 等 8在進(jìn)行外源鈣對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的橡膠 樹轉(zhuǎn)基因影響的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) , 在無 CaCl 2培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)2個(gè)星期的愈傷組

8、織 , 內(nèi)源鈣降低了 91%, 細(xì)胞接受外源基因的活性增加。 另外 , 培養(yǎng)基中其他成分如激素、 有機(jī)營養(yǎng) 物質(zhì)等 , 都能使細(xì)胞處于活化狀態(tài) , 更容易接受外源基因。 例如 ,NAA 與 62BA 的使用可以明顯提高水稻的轉(zhuǎn)化效率 , 而 ABA 則明顯降低轉(zhuǎn)化率9。2 侵染液制備方法的優(yōu)化侵染液的制備是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵之一 , 侵染液中農(nóng)桿 菌的活力直接關(guān)系到共培養(yǎng)中農(nóng)桿菌的侵染能力。 農(nóng)桿菌 液體培養(yǎng)方法通常有兩種 :一種是先通過小管培養(yǎng) , 得到一 定體積的農(nóng)桿菌菌液后 , 轉(zhuǎn)入三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)到一定的光 密度 OD 值 ; 另一種是培養(yǎng)到一定濃度后 , 用固定體積的液 體培養(yǎng)基稀釋一

9、定的倍數(shù)到需要的光密度 OD 值。 王文燕 等10在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo) Lesquerella fendleri L. 轉(zhuǎn)化的研究中認(rèn)為 , 農(nóng)桿菌培養(yǎng)至一定的 OD 600值比重新懸浮至一定的OD 600值轉(zhuǎn)化率高。 原因可能是直接培養(yǎng)的農(nóng)桿菌的活性比稀釋重新懸浮后的農(nóng)桿菌活性高 , 因此感染能力強(qiáng)。為了提高農(nóng)桿菌的侵染能力 , 通常會(huì)在侵染液中添加一 些輔助物質(zhì)。 AS 是最多用于誘導(dǎo) vir 基因轉(zhuǎn)錄活化的酚類 物質(zhì) , 已證實(shí) AS 對(duì)多種植物的農(nóng)桿菌誘導(dǎo)有效 , 并且 AS 的 促進(jìn)效果與菌株類型、 植物材料種類和共培養(yǎng)培養(yǎng)基的 pH 值有關(guān)。 AS 的添加方法有 3種 :共培養(yǎng)培養(yǎng)基中

10、添加、 侵染 液中添加及在侵染液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中同時(shí)添加 , 其效果視 不同植物而異 , 而且同種外植體對(duì)于不同添加方式的效果也 不同。 范春節(jié)11用尾赤桉葉片和莖段作為外植體 , 分別在共培養(yǎng)培養(yǎng)基、 農(nóng)桿菌懸浮液 , 以及同時(shí)在二者中都添加 , 試驗(yàn)結(jié)果表明 , 以莖段為外植體時(shí) , 在菌液中添加 100mol/L安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) , Journal of Anhui Agri . Sci . 2010, 38(3 :1141-1143, 1202責(zé)任編輯 熊章琴 責(zé)任校對(duì) 盧瑤AS, 轉(zhuǎn)化率約為 50%, 而在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加 AS 會(huì)抑制 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率 ; 以葉片為外植體時(shí) , 無論

11、是在共培養(yǎng)培 養(yǎng)基中單獨(dú)添加還是在菌液中單獨(dú)添加都能提高轉(zhuǎn)化效率 , 但同時(shí)添加反而效果不明顯。 在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加 100mol/LAS, 轉(zhuǎn)化率為 46. 7%, 而對(duì)照為 20%。 張曉英等 12對(duì)國槐遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化試驗(yàn)表明 , 國槐葉片在侵染前的 菌液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中分別添加 200mol/LAS 能夠提高 轉(zhuǎn)化頻率 5. 35、 3. 32倍。 也有研究者認(rèn)為乙酰丁香酮在低 pH 值條件下的效果更好。 郝貴霞等 13對(duì)毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化 研究表明 , 只有將 pH 值調(diào)至 4. 85. 0, 加入 200mol/LAS 時(shí) , 才能大大提高轉(zhuǎn)化率。 楊秀榮等 14研究了乙酰丁香酮

12、對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯遺傳轉(zhuǎn)化的影響 , , 在培養(yǎng)基 pH 值為 5. 8時(shí)加入 AS,為 4. 0%12. 5%,至 5. 2后 , 加入 特別是 AS 的濃度為 25, 卡那霉素抗性芽獲得率提高到 35. 7%。植物受傷后除了大量釋放酚類物質(zhì) , 還會(huì)釋放糖類等小 分子 , 這些小分子一方面可作為化學(xué)源吸引農(nóng)桿菌的趨化運(yùn) 動(dòng) , 另一方面可誘導(dǎo)或抑制農(nóng)桿菌 vir 基因的表達(dá)。 酚類化 合物的作用是吸引農(nóng)桿菌的趨化運(yùn)動(dòng) , 與農(nóng)桿菌染色體基因 編碼的 P10、 P21蛋白結(jié)合 , 激活 vir A 蛋白進(jìn)而誘導(dǎo)農(nóng)桿菌 vir 基因的表達(dá)。 而糖類的主要作用是與農(nóng)桿菌染色體毒性 蛋白 Ch

13、vE 結(jié)合 , 激活 vir A 蛋白進(jìn)而誘導(dǎo) vir 基因高水平表達(dá) 和擴(kuò)大農(nóng)桿菌的寄主范圍。 特別在 AS 濃度很低的情況下 , 它們可強(qiáng)烈誘導(dǎo) vir 基因的表達(dá) , 并且與 AS 存在協(xié)同效應(yīng) , 可顯著提高 AS 誘導(dǎo)效果。 劉斌等 15在反義磷脂酶 D 基因 轉(zhuǎn)化毛白楊的研究中 , 對(duì)傳統(tǒng)的侵染液制備方法進(jìn)行了改 良 , 將已經(jīng)培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液用 13倍的 5%蔗糖附加一 定濃度的表面活性劑稀釋菌液制成侵染液 , 將切好的葉片置 于侵染液中侵染 , 得到的再生芽經(jīng) PCR 檢測(cè)為轉(zhuǎn)基因芽。 這種侵染液的制備方法既增加了侵染液中蔗糖的濃度 , 又減 去了離心操作步驟 , 并且達(dá)到了

14、在浸染液中附加一定量的乙 酰丁香酮同樣的作用 , 其結(jié)果比只用液體培養(yǎng)基稀釋更好 些。 H iei 等 16認(rèn)為較低的 pH 值、 低于 28 的溫度、 較高的 滲透壓、 適當(dāng)濃度的冠癭堿及一些糖類等都能有效地增強(qiáng)基 因的表達(dá)。 糖類在不含酚類化合物的情況下效果較明顯 , 但 是糖類和酚類化合物同時(shí)存在時(shí)卻沒有明顯的協(xié)同效應(yīng)。 多胺 (Polya m ines, P A s 腐胺、 亞精胺等 是一種生物體中 廣泛存在的代謝產(chǎn)物 , 是具有調(diào)控作用的低分子量脂肪族含 氮堿 17-18。 多胺也參與植物宿主和病原之間的相互作用。 Ku mar 等 19曾用多胺物質(zhì)對(duì)農(nóng)桿菌進(jìn)行活化后侵染煙草做 G

15、US 瞬時(shí)表達(dá)研究 , 結(jié)果表明農(nóng)桿菌的侵染活力顯著提高。 祖勇 20利用多胺對(duì)攜帶植物表達(dá)載體 pB I 121的農(nóng)桿菌 EHA105進(jìn)行活化之后侵染歐美楊 107的葉環(huán)。 G US 瞬時(shí)表 達(dá)分析表明多胺活化使農(nóng)桿菌的侵染效率增強(qiáng) , 腐胺和亞精 胺處理分別為對(duì)照的 2. 4、 1. 8倍。 經(jīng)腐胺處理的 EHA105侵 染歐美楊 107葉環(huán)所獲得的 G US 瞬時(shí)表達(dá)效果優(yōu)于亞精胺。 3 接種方式的優(yōu)化比較常用的接種方式是將外植體置于侵染液中浸泡 , 時(shí) 間長(zhǎng)短視菌種和外植體種類而異。 有的研究者在浸泡的基 礎(chǔ)上結(jié)合了振蕩進(jìn)行接種 , 得到了轉(zhuǎn)基因植物。席夢(mèng)利 等 21在研究不同因素對(duì)農(nóng)

16、桿菌介導(dǎo)的杉木轉(zhuǎn)化效率影響的 試驗(yàn)中 , 將莖段外植體進(jìn)行振蕩接種 , 經(jīng)過 PCR 檢測(cè)得到了 抗性芽。 振蕩培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)在于通過振蕩打破細(xì)胞表面的氣 泡 , 使農(nóng)桿菌與外植體的接觸面增大 , 有利于農(nóng)桿菌侵染。 近年來 , 在提高遺傳轉(zhuǎn)化效率方面發(fā)展了一些新技術(shù) , 如超 聲 波 輔 助 農(nóng) 桿 菌 介 導(dǎo) 法 (S AAT:s onicati onassisted Agrobacterium mediated transf or mati on 負(fù)壓與農(nóng)桿菌介導(dǎo)結(jié) , 均可增強(qiáng)農(nóng)桿菌浸 染 , ,22S AAT 法將外源基因轉(zhuǎn)入大豆中 , 其轉(zhuǎn)化效率顯著高于單純的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。 姜玲等 2

17、3以番木瓜品種 Sunset 的胚性愈傷組織為試驗(yàn)材料 , 用超聲波 處理 15s 后得到 26. 3%的轉(zhuǎn)化率。 S AAT 法在林木遺傳轉(zhuǎn) 化方面也取得了一定的進(jìn)展。 Santar ém 等 24在將 gus 基因 和 hpt 基因轉(zhuǎn)化棕櫚的研究中發(fā)現(xiàn) , 采用 S AAT 法的轉(zhuǎn)化效 率比采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法提高 30%45%。 可能由于超聲波 處理可在受體材料表皮和深層造成許多微損傷 , 有利于農(nóng)桿 菌進(jìn)入組織內(nèi)部 , 同時(shí)從傷口處分泌出較多的酚類物質(zhì) , 有 助于提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化活力 , 明顯地提高農(nóng)桿菌的感染效 率。 另外 , Zarag oza 等 25將抗除草劑基因 ba

18、r 通過 S AAT 轉(zhuǎn) 入刺槐 , 獲得轉(zhuǎn)基因植株。負(fù)壓處理會(huì)在轉(zhuǎn)化材料上形成許多細(xì)小的傷口 , 導(dǎo)致組 織液大量外流 , 流傷液中的酚類物質(zhì)可刺激農(nóng)桿菌的活力 , 同時(shí)大量細(xì)小傷口的形成可提高農(nóng)桿菌侵染的機(jī)會(huì) 26。 畢 瑞明 27以六倍體普通小麥 HB341、 S N2618、 TS021和四倍體 栽培二粒小麥成熟種子為試材 , 采用整粒切胚誘愈的方法 , 通過農(nóng)桿菌 G V3101pB I 121:gus 介導(dǎo) , 研究負(fù)壓處理對(duì)小麥 成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化的影響。 結(jié)果表明 , 負(fù)壓處理對(duì)小麥成熟胚 愈傷組織的誘導(dǎo)沒有顯著影響 , 但對(duì)小麥成熟胚的遺傳轉(zhuǎn)化 卻有顯著性影響。 負(fù)壓處理能夠提高

19、小麥成熟胚轉(zhuǎn)化效率 , 分別較對(duì)照組提高了 9. 37、 10. 90和 10. 03倍。 但是負(fù)壓處 理造成的傷口也會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成一定的傷害 , 使用 T ween 處理能夠?qū)?xì)胞起到一定的保護(hù)作用 , 可降低細(xì)胞傷害 , 在 提高轉(zhuǎn)化率的同時(shí)提高存活率 22。 劉志學(xué)等 28以水稻愈傷 組織為受體材料 , 在與菌液混合時(shí)輔以 T ween20和負(fù)壓處 理 , 用 gus 報(bào)告基因的瞬間表達(dá)作為指標(biāo) , 與僅用 T ween20或 僅用負(fù)壓處理的樣本進(jìn)行了比較研究。 試驗(yàn)結(jié)果表明 , 適當(dāng) 的負(fù)壓處理可提高轉(zhuǎn)化頻率 , 而過度的負(fù)壓處理會(huì)對(duì)材料造 成較大的傷害 , 從而降低其成活率 , 如

20、同時(shí)使用 T ween20可 以減輕這種傷害。此外 , 有人基于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化機(jī)理結(jié)合基因槍法創(chuàng)建了 “ 農(nóng)桿槍法 ” (Agrolistic , 將 V ir D1、 V ir D2基因連 T 2DNA 上的 目的基因一同用基因槍打入植物細(xì)胞中 , 表達(dá)的 V ir D1、 V ir D2能在植物細(xì)胞內(nèi)切割保守序列并一起轉(zhuǎn)入細(xì)胞核。 該 方法集中了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法中精確切割轉(zhuǎn)移和低拷貝整合 等特性以及基因槍法中無宿主范圍限制的優(yōu)點(diǎn) , 因而是一種 有發(fā)展前途的新思路。2411 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2010年 4 共培養(yǎng)中除菌方式優(yōu)化及激素添加問題共培養(yǎng)是整個(gè)轉(zhuǎn)化過程中非常重要的環(huán)節(jié) , 因?yàn)檗r(nóng)桿菌 附著

21、、 T 2DNA 的轉(zhuǎn)移及整合都在這一時(shí)期內(nèi)完成。 共培養(yǎng)時(shí) 的有 3個(gè)關(guān)鍵技術(shù) :共培養(yǎng)的時(shí)間、 農(nóng)桿菌的增殖適度和共 培養(yǎng)中激素的影響。 共培養(yǎng)的時(shí)間主要采用 G US 染色來確 定 , 表達(dá)率高、 染色面積大為優(yōu)。 農(nóng)桿菌的增殖適度直接與 轉(zhuǎn)化有關(guān) , 如果農(nóng)桿菌增殖生長(zhǎng)不良 , 只有很少的農(nóng)桿菌生 長(zhǎng) , 則轉(zhuǎn)化的幾率很小 , 反之 , 農(nóng)桿菌在外植體四周過度生 長(zhǎng) , 可能引起外植體毒害 , 褐化死亡 1。 劉斌等 15將農(nóng)桿菌 侵染后的葉片不經(jīng)沖洗而直接轉(zhuǎn)到預(yù)先用濃度 5%蔗糖液浸 濕的濾紙上過夜 , 既延長(zhǎng)了農(nóng)桿菌浸染時(shí)間又不致因葉片在 菌液中浸泡時(shí)間過長(zhǎng)而壞死 ,試驗(yàn)證明 ,

22、,桿菌 , 29。 另外 , Jassen 等 30, 加濾紙 顯著優(yōu)于不加濾紙 , 前者的 G US 短暫表達(dá)率為 10%34%, 后者僅為 2%16%。 而馮勤等 31也認(rèn)為農(nóng)桿菌與外植體 共培養(yǎng)時(shí) , 固體培養(yǎng)基表面加 12層滅菌濾紙有利于控制 外植體上的農(nóng)桿菌過度繁殖 , 防止外植體褐化壞死。 易自力 等 32在洗菌之后 , 將水稻愈傷組織置無菌濾紙上干燥培養(yǎng) , 以除去組織中多余的水分。 結(jié)果表明 , 通過這種干燥處理 后 , 既能有效提高愈傷組織的存活率和分化率 , 又能有效抑 制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。共培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中是否加激素目前還沒有定論 , 大多數(shù) 人采用添加激素的方法。 程家勝 3

23、3認(rèn)為共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中 附加一定量的植物激素是非常必要的。 劉慶忠等 34報(bào)道培 養(yǎng)基中附加生長(zhǎng)素極大地提高轉(zhuǎn)化率。 而 De Bondt 等 35則 認(rèn)為培養(yǎng)基中含有高濃度細(xì)胞分裂素比含高濃度的生長(zhǎng)素 對(duì)基因轉(zhuǎn)移更有利 , 外植體在感染農(nóng)桿菌后或由于抗生素的 加入 , 細(xì)胞的生長(zhǎng)受到影響 , 往往要調(diào)整培養(yǎng)基的成分促進(jìn) 外植體的再生。 共培養(yǎng)時(shí)的光照視植物種類而異 , 有些植物 需要光培養(yǎng) , 有些需要暗培養(yǎng)。 有研究顯示連續(xù)光照能顯著 提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株的效率 , 但是具體機(jī)制還不清楚 , 可能 是光照提高了寄主細(xì)胞對(duì) T 2DNA 復(fù)合物的接納能力 36。 5 褐變問題的優(yōu)化處理在選擇培

24、養(yǎng)的后期 , 外植體褐變是比較常見的問題 , 同 時(shí)也是誘導(dǎo)脫分化及再生芽的重大障礙。 褐變主要與外植 體受損、 培養(yǎng)基水勢(shì)及外植體轉(zhuǎn)移時(shí)間有關(guān)。 張妙霞等 37在研究柿樹的玻璃化現(xiàn)象中報(bào)道 , 培養(yǎng)基中瓊脂粉含量由 6 g/L提高到 10g/L后 , 培養(yǎng)基的水勢(shì)降低了 0. 030. 04 MPa, 試管苗的水勢(shì)降低了 0. 09MPa, 減輕了褐變。 在其他 植物上 , 也有許多報(bào)道認(rèn)為 , 保持溫和的滲透脅迫 , 對(duì)植株再 生有很大的影響 , 可能是因?yàn)楦邼舛鹊沫傊瑢?duì)愈傷組織產(chǎn)生 了一種水分或營養(yǎng)脅迫 , 或者引起愈傷組織透氣性的增加 , 從而減少愈傷組織的褐變 38。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物

25、遺傳轉(zhuǎn)化是一個(gè)復(fù)雜的生物過程 , 受 多種因子共同作用。 一些常規(guī)的基本轉(zhuǎn)化因子確定后 , 并不 能保證建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因體系是高效的 , 所以對(duì)遺傳 轉(zhuǎn)化的主要因素進(jìn)行優(yōu)化是十分必要的。 優(yōu)化的過程就是 尋找各個(gè)作用因素的最佳組合 , 使之都高效地發(fā)揮作用。 這 樣不僅可以提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力 , 而且會(huì)節(jié)省時(shí)間和材料 , 起到事半功倍的效果。參考文獻(xiàn)1王關(guān)林 , 方宏筠 . 植物基因工程 M.2版 . 北京 :科學(xué)出版社 , 2002. 2韋大器 . 林木抗病基因工程進(jìn)展 J .亞熱帶植物科學(xué) , 2005, 34(3 :74 -77.3肖尊安 . 植物生物技術(shù) M.北京 :化學(xué)工業(yè)出版

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36、 結(jié)果 表明 , 隨著水分脅迫程度的加深 , 桃樹葉片可溶性蛋白含量 降低 , 游離氨基酸含量增加 , 硝酸還原酶 (NR 、 谷氨酸合酶 (G OG AT 、 谷氨酰胺合成酶 (GS 活性降低 , 谷氨酸脫氫酶 (G DH 活性先升高后降低。硝酸還原酶 (NR 是植物氮代謝中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)酶 和限速酶 13。 NR 對(duì)水分脅迫非常敏感 14。 該試驗(yàn)結(jié)果表 明 , 隨著水分脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)桃樹葉片 NR 活性逐漸降低 , 且 NR 活性下降幅度表現(xiàn)為 :處理 >處理 。 植物氮素吸收 主要依靠 GS/GOG AT 循環(huán)。 目前 , 谷氨酰胺合成酶 (GS 與 谷氨酸合酶 (G OG AT

37、 構(gòu)成的循環(huán)被認(rèn)為是高等植物氨同化 的主要途徑 15。 水分脅迫下 GS片 NH4+2N 積累 , 該試驗(yàn)中桃樹葉片 GS G AT 均低于 CK, :G OG AT NR , 使得 NO 3 -還原、 NH4+, NH4+及中間產(chǎn)物2酮 戊二酸供應(yīng)不足所致。 谷氨酸脫氫酶 (G DH 是一類廣 泛存在于植物、 動(dòng)物、 微生物中的氧化還原酶 , 其催化的主要 反應(yīng) 是 :谷 氨 酸 +NADP 2酮 戊 二 酸 +NADPH + NH 4+。 研究表明 , 植物在水分脅迫、 鹽漬、 污染及病原菌侵 染條件下均會(huì)引起 G DH 活性變化 11。 該研究結(jié)果表明 , 由 于 GS/GOG AT 途

38、徑的限制 , 使得在水分處理前期桃樹葉片 G DH 酶活性提高 , 其原因可能是處理前期 GS 活性降低 , 使 NH 4+離子同化受阻 ,NH 4+發(fā)生積聚所致 16。 但隨著處理時(shí) 間的延長(zhǎng) , G DH 活性呈下降趨勢(shì)。目前 , 有關(guān)逆境影響植物氮代謝過程中關(guān)鍵酶活性的研 究結(jié)果尚存在較大差異 , 但根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果可知 , 逆境條 件不僅對(duì)植物體內(nèi)氮代謝關(guān)鍵酶的活性產(chǎn)生影響 , 而且可引 起植物氮代謝途徑的改變 , 這可能與植物對(duì)逆境的適應(yīng)性調(diào) 節(jié)有關(guān)。 參考文獻(xiàn)1孫洪強(qiáng) , 龐占榮 , 蔣春光 . 水分脅迫對(duì)果樹形態(tài)和生理生化指標(biāo)的影響 J.北方果樹 , 2008(1 :1-3.2B

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