提取分離鑒定的方法和技術(shù)3剖析

1、商洛職業(yè)技術(shù)學(xué)院教案課程名稱天然藥物化學(xué)專業(yè)班級(jí)06藥學(xué)授課教師顧曉燕授課類型講授學(xué)時(shí)2章節(jié)題目第二節(jié) 天然藥物化學(xué)成分分離、精制、鑒定的方法與技術(shù)（二）目的 與 要求掌握吸附色譜法、分配色譜法的分離原理、操作技術(shù)及在天然藥物化學(xué)中的應(yīng)用重點(diǎn)與難點(diǎn)重點(diǎn)：原理難點(diǎn):操作方法方法與手段講授使用教材及參考書天然藥物化學(xué)主編:吳劍鋒 出版社:人民衛(wèi)生出版社天然藥物化學(xué)學(xué)習(xí)指導(dǎo)主編:吳劍鋒 出版社:人民衛(wèi)生出版社教案續(xù)頁(yè)教學(xué) 內(nèi) 容輔助手段 時(shí)間分配第二節(jié)天然藥物化學(xué)成分分離、精制、鑒定的方法與技術(shù)（二）五、色譜法（一）吸附色譜法以固一液吸附用的最多，并有物理吸附（硅膠、氧化鋁、活性炭為吸附劑進(jìn)行的吸附

2、色譜）、化學(xué)吸附（黃酮等酚酸性物質(zhì)被氧化鋁吸附、生物堿被酸性硅膠吸附等）及半化學(xué)吸附（聚酰胺與黃酮類、醌類等酚性化合物之間的氫鍵吸附，吸附力較弱，介于物理吸附與化學(xué)吸附之間）之分。1、基本原理物理吸附過程一般無(wú)選擇性，但吸附強(qiáng)弱大體遵循“相似者易于吸附”的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律。被分離的物質(zhì)與吸附劑、洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析的三要素，彼此緊密相連。適用于中等分子量的脂溶性物質(zhì)的分離。2、常用的極性吸附劑：（1）硅膠：顯微酸性，適于分離酸性和中性化合物，分離生物堿時(shí)需在流動(dòng)相中加入適量的有機(jī)堿；（2）氧化鋁：有三種類型，堿性中性酸性，適于分離堿性或中性的親脂性成分，尤其對(duì)生物堿的分離應(yīng)用的最多。 不且用于分離有

3、機(jī)酸、酚性等酸性成分。（3）聚酰胺：一般認(rèn)為系通過分子中的酰胺基與酚類、黃酮類化合物的酚羥基，或酰胺鍵上的游離胺基與醌類、脂肪酸上的羰基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附。吸附強(qiáng)弱取決于各種化合物與之形成氫鍵締合的能力。吸附能力的強(qiáng)弱，通?；衔镌谒軇┲写笾掠幸韵乱?guī)律：形成氫鍵的基團(tuán)數(shù)目越多，則能力越強(qiáng)。成鍵位置對(duì)吸附能力也有影響。易形成分子內(nèi)氫鍵者，其在聚酰胺上的吸附響應(yīng)減弱。分子中芳香化程度高這，貝帔附性增強(qiáng)；反之，貝U減弱。一般情況下，各種溶劑在聚酰胺柱上的洗脫能力由弱致強(qiáng)的大致順序如下： 水一甲醇一乙醇一氫氧化鈉水溶液一甲酰胺一二甲基甲酰胺一尿素水溶液其中，最常應(yīng)用的洗脫系統(tǒng)是：乙醇一水應(yīng)用于特

4、別適合于酚類、黃酮類化合物的制備和分離。 脫鞣質(zhì)處理對(duì) 生物堿、萜類、甾類、糖類、氨基酸等其他極性與非極性化合物的分離也有著 廣泛的用途。以上均為極性吸附劑，故有以下特點(diǎn)： 被分離物質(zhì)極性越強(qiáng)，吸附力越強(qiáng)。強(qiáng)極性溶質(zhì)將優(yōu)先被吸附。 溶劑極性越弱，則吸附劑對(duì)溶質(zhì)的吸附能力越強(qiáng)。隨溶劑極性的增強(qiáng)，則吸附劑對(duì)溶質(zhì)的吸附力將減弱。 當(dāng)加入極性較強(qiáng)的溶劑后，先前被硅膠或氧化鋁所吸附的溶質(zhì)可被置換而洗 脫出來。常用的非極性吸附劑：活性炭。對(duì)非極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和力， 在水中對(duì)溶質(zhì)表現(xiàn)出強(qiáng)的吸附能力。從活性炭上洗脫被吸附的物質(zhì)時(shí)，溶劑的極性越小， 洗脫能力越強(qiáng)。（4）活性炭：為一種非極性吸附劑，具有較強(qiáng)的

5、吸附能力，在水中吸附能力最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中吸附能力較弱。對(duì)極性基團(tuán)多的吸附力強(qiáng)于極性基團(tuán)少的化合物，對(duì)芳香族化合物吸附力大于脂肪族化合物；對(duì)分子量大的化合物吸附力大于分子 量小的化合物。適用于分離水溶性成分如氨基酸、糖類即某些苷類等。3、 溶劑 溶劑的極性可大體根據(jù)介電常數(shù)的大小來判斷。 介電常數(shù)越大，則 極性越大。一般溶劑的介電常數(shù)按下列順序增大： 環(huán)己烷（1.88 ），苯（2.29）， 無(wú)水乙醚（4.47 ），氯仿（5.20），乙酸乙酯（6.11），乙醇（26.0），甲醇（31.2）， 水（81.0）4、被分離物質(zhì)一般化合物的極性按下列官能團(tuán)的順序增強(qiáng)：CH2- CH, CH2=CH， O

6、CH3 COOR>C=O CHQ NH2 OHCOOH5、操作方式（1）薄層色譜法：具體操作步驟如下： 制板 點(diǎn)樣 展開 顯色 測(cè)定比移值（2）柱色譜法具體操作如下： 裝柱 加樣 洗脫吸附柱色譜法用于物質(zhì)的分離，以硅膠或氧化鋁為吸附劑進(jìn)行柱色譜分離 時(shí)應(yīng)注意：（1）盡可能選用極性小的溶劑裝柱和溶解樣品，或用極性稍大的溶劑溶解樣品后，以少量吸附劑拌勻揮干，上柱。（2）一般以TLC展開時(shí)使組分Rf值達(dá)到0.20.3的溶劑系統(tǒng)作為 最佳溶劑系統(tǒng)進(jìn)行洗脫。實(shí)踐中多用混合的有機(jī)溶劑系統(tǒng)。（3）為避免化學(xué)吸附，酸性物質(zhì)宜用硅膠、堿性物質(zhì)宜用氧化鋁作 為吸附劑進(jìn)行分離。通常在分離酸性（或堿性）物質(zhì)時(shí)，

7、洗脫溶劑中常加入適 量的醋酸（或氨、吡啶、二乙胺），以防止拖尾、使斑點(diǎn)集中。（二）分配色譜法利用混合物中各成分在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)的不同來達(dá)到分離 的色譜分離方法。1、基本原理混合物中各成分在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)的不同來達(dá)到分離2、支持劑常用的有硅膠、硅藻土、纖維素粉和濾紙等3、溶劑系統(tǒng)一般為復(fù)合溶劑4、被分離物質(zhì)一般在正相分配色譜中，因移動(dòng)相極性較固定相極性小，故被分離物質(zhì)中極性小的成分隨移動(dòng)相遷移速度較快。5、操作方式（1）紙色譜（PPC：紙色譜的原理與液一液萃取法基本相同。原理：分配原理支持劑：纖維素固定相：水流動(dòng)相：水飽和的有機(jī)溶劑 Rf值：化合物極性 越小，Rf值越

8、大；反之，化合物極性越大，Rf值越小。應(yīng)用：用作微量分析， 特別適合于親水性較強(qiáng)的成分，其層析效果往往比吸附薄層色譜效果好。但紙 層析一般需要較長(zhǎng)的時(shí)間。具體操作步驟如下： 點(diǎn)樣 展開 顯色 測(cè)定比移值（2）液一液分配薄層色譜法：液一液分配色譜法也可在硅膠薄層色譜上進(jìn)行。因此，液一液分配柱色譜 的最佳分離條件可以根據(jù)相應(yīng)的薄層色譜結(jié)果（正相柱用正相薄層色譜，反相 柱用反相薄層色譜）進(jìn)行選定。（3）液一液分配柱色譜：原理：分配原理支持劑：硅膠、硅藻土、纖維素粉等正相分配色譜： 固定相：水、緩沖溶液流動(dòng)相：固定相飽和的氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱極性有機(jī)溶劑洗脫順序：化合物極性越小，越先出柱；反之，化

9、合物極性越大，越后 出柱。應(yīng)用：通常用于分離水溶性或極性較大的成分， 如生物堿、苷類、糖類、 有機(jī)酸等化合物。反相分配色譜： 固定相：石蠟油、化學(xué)鍵合固定相流動(dòng)相：固定相飽和的水或甲醇等強(qiáng)極性有機(jī)溶劑洗脫順序：化合物極性越大，越先出柱；反之，化合物極性越小，越后 出柱。應(yīng)用：適合于分離脂溶性化合物，如高級(jí)脂肪酸、油脂、游離甾體等。 常用反相硅膠薄層色譜及柱色譜的填料是普通硅膠經(jīng)下列方式進(jìn)行化學(xué)修飾， 鍵合上長(zhǎng)度不同的烴基（R）、形成親油表面而成。其中以硅烷化鍵合型最為常 用，其根據(jù)烴基（R）長(zhǎng)度（一C2H5 C8H17 C18H37）分別命名為：RF 2、 RF & RF18。三者親脂

10、性強(qiáng)弱順序如下： RF18> RP 8> RP 2。鍵合固定相的作用并非只是分配，也有一定的吸附作用。教案末頁(yè)教學(xué)小結(jié)通過教學(xué)學(xué)生很好的掌握了吸附色譜法、 分配色譜法的分離原理、操作技術(shù)及在天然藥物化學(xué)中的應(yīng)用思考題 或作業(yè)題1色譜法的基本原理是什么？2聚酰胺吸附力與哪些因素有關(guān)。3、硅膠吸附柱色譜常用的洗脫劑類型是A以水為主B酸水C堿水D以醇為主E以親脂性溶劑為主4、硅膠CMC!層色譜中CM（是指A指示劑B顯色劑C絡(luò)合劑D吸附劑E粘合劑5、卜夕列基團(tuán)極性最大的是A醛基B酮基C酯基D酚羥基E甲氧基6、聚酰胺在何種溶劑中對(duì)黃酮類化合物吸附最強(qiáng)A水B丙酮C乙醇D氫氧化鈉水溶液E甲醇7、正相分配色譜常用的固定相為A氯仿B甲醇C水D正丁醇E乙醇8影響硅膠吸附能力的因素有A硅膠的含水量B洗脫劑的極性大小C被分離成分的極性大小 D洗脫 劑的酸堿性大小E被分離成分的酸堿性大小9、硅膠薄板活化最適宜的溫度和時(shí)間是A100 C 60min B100-150 C 60min C 100-110 C 30min D 110