二氧化硫?qū)Υ篼溣酌绲难趸瘬p傷效應(yīng)

1、二氧化硫?qū)Υ篼溣酌绲难趸瘬p傷效應(yīng)儀慧蘭，李秀娟，劉靜山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030006摘要：以大麥（Hordeum vulgare L.）為材料，研究SO2水合物NaHSO3-Na2SO3混合液（13，mmol L-1: mmol L-1）對大麥幼苗的氧化損傷效應(yīng)。結(jié)果表明，大麥幼苗的生長受SO2水合物濃度和作用時間的影響，低濃度促進(jìn)幼苗生長，高濃度抑制生長，抑制效應(yīng)隨作用時間的延長而增強(qiáng)；在脅迫6 d后，大麥葉組織中的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性增高，還原型谷胱甘肽（GSH）含量上升。加入外源抗氧化劑抗壞血酸（AsA）后，SO2水合物對大

2、麥幼苗生長的抑制效應(yīng)得到緩解，膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量降低。研究結(jié)果表明：SO2水合物處理能引起大麥幼苗氧化脅迫，誘導(dǎo)抗氧化酶表達(dá)增強(qiáng)、活性氧清除能力提高，但活性氧的增加又會引起細(xì)胞氧化損傷，SO2對植物的傷害與其對細(xì)胞的氧化損傷有關(guān)。關(guān)鍵詞：二氧化硫；大麥；氧化脅迫中圖分類號：Q945.78；X171.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-2175（2008）04-1442-04硫是植物必需的元素，低濃度二氧化硫（SO2）能促進(jìn)植物生長，特別是土壤中含硫不足時。但是，環(huán)境中高濃度的SO2能引起植物可見傷害，誘發(fā)葉面退綠或壞死斑，抑制光合作用，影響植物的生長發(fā)育1,2。研究表明，S

3、O2進(jìn)入植物體后在細(xì)胞內(nèi)首先轉(zhuǎn)化為HSO3-和SO32-，之后SO32-被氧化成SO42-，在此氧化過程中產(chǎn)生活性氧，如OH，O2-和H2O2等3。生理條件下，植物體內(nèi)具有一定的保護(hù)系統(tǒng)，如酶系統(tǒng)的超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT），非酶系統(tǒng)的谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（AsA）等，它們協(xié)同作用使細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基維持在一定水平，維持細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能4。逆境脅迫時，細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)會發(fā)生適應(yīng)性改變，以提高對活性氧的防護(hù)作用；但若胞內(nèi)產(chǎn)生了過多的活性氧自由基，就會對細(xì)胞產(chǎn)生一系列毒害作用。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，SO2對植物的傷

4、害與活性氧有關(guān)，但到目前為止，有關(guān)SO2傷害機(jī)理缺乏直接的實驗證據(jù)。本文根據(jù)SO2進(jìn)入生物體后以它的水合物NaHSO3-Na2SO3(1:3，mmol L-1：mmol L-1)的形式對生物體產(chǎn)生作用的事實5，研究其對敏感植物大麥幼苗的氧化脅迫效應(yīng)，為SO2毒性機(jī)理提供實驗依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料 大麥(Hordeum vulgare L.)為“晉科571”。1.2 實驗方法 1.2.1 幼苗培養(yǎng) 種子用10%的NaClO浸泡0.5 h，蒸餾水沖洗，浸種3 h后用濕紗布包裹，25 暗培養(yǎng)。待種子露白后，采用濾紙法發(fā)芽，水培24 h后用于實驗。1.2.2 藥物處理 取生長均勻一致的幼苗隨

5、機(jī)分組。SO2處理組采用NaHSO3-Na2SO3混合液（1:3，mmol L-1mmol L-1）培養(yǎng)，濃度分別為0.1、0.5、 L-1（以Na2SO3濃度計）。對照組用蒸餾水培養(yǎng)。抗壞血酸（AsA）緩解組選水培5 d的幼苗，用10 mg L-1 AsA預(yù)處理2.5 h后，10 mmol L-1的NaHSO3-Na2SO3混合液處理12 h，設(shè)同期的AsA、SO2水合物及水對照組。12 h換1次新處理液，每處理設(shè)3個重復(fù)組。處理結(jié)束后測量每組20株幼苗的株高、根長及葉片MDA含量。1.2.3 酶活性、GSH、MDA及蛋白質(zhì)含量的測定處理6 d后取幼葉提取酶液。SOD活性測定采用NBT光還原

6、法6268-270；CAT活力測定采用紫外吸收法7；GSH-Px活性測定參照Floh和Gnzler的方法8；GSH含量測定參照E11man的方法9；丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸（TAB）顯色法6。蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法6159-160，用牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3 數(shù)據(jù)處理 計算每個處理3個重復(fù)組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，方差分析后采用Duncan法進(jìn)行處理組與對照組之間的比較，差異顯著性表示：*為P0.05；*為P0.01。2 結(jié)果與分析2.1 SO2水合物對大麥幼苗生長的影響SO2水合物對大麥幼苗生長發(fā)育的影響依賴于濃度和處理時間（圖1）。處理6 d后，0.

7、1 mmol L-1組幼根最長，濃度大于0.5 mmolL-1的組根和芽生長抑制；隨處理時間延長，處理和對照組間的生長差異增大，不同濃度SO2處理均表現(xiàn)對根生長的抑制，但0.1 mmol L-1和0.5 mmol L-1處理能促進(jìn)芽的生長。對根和芽生長效應(yīng)的差異可能是因為根部直接暴露于處理液中，而根部吸收的亞硫酸根往上部轉(zhuǎn)移的量較少引起的。處理6 d后對照組芽最長，說明SO2水合物對芽的萌生具有抑制作用；但硫是植物必須元素，低濃度硫能促進(jìn)芽的生長，所以8 d后0.1 mmol L-1和0.5 mmol L-1組的株高超過了對照組。圖1 SO2水合物對大麥幼苗根長和芽長的影響Fig.1 Effe

8、ct of sulfur dioxide hydrates on the length of roots and shoots of barley seedlings2.2 SO2水合物對葉片抗氧化酶活性及GSH含量的影響經(jīng)0.110 mmol L-1的SO2水合物處理后，大麥幼葉SOD活性增高。但CAT活性僅在0.1 mmol L-1組升高，其余處理組降低，2.5 mmol L-1和10.0 mmol L-1組降低尤為顯著（圖2）。研究表明，逆境脅迫時植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基大量產(chǎn)生并積累，會導(dǎo)致SOD、POD和CAT等結(jié)構(gòu)的破壞，活性降低10，本文中高濃度組SOD、CAT活性降低的結(jié)果與此

9、相一致。 圖2 SO2水合物對大麥幼苗葉片抗氧化酶活性及GSH含量的影響Fig.2 Effect of sulfur dioxide hydrates on antioxidant enzymes activities and GSH content in barley seedling leaves細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH-Px、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等均具有清除H2O2的作用4，CAT活性的降低與H2O2在體內(nèi)的積累直接相關(guān)11。SO2脅迫時，SOD的過量表達(dá)可加速O2-的歧化，使細(xì)胞內(nèi)積累大量的H2O2；此時，若CAT活性較高，可及時清除H2O2，若CAT活性較低，積累的H2O2可與剩

10、余的O2-反應(yīng)產(chǎn)生活性更強(qiáng)的OH，導(dǎo)致植物的氧化損傷3。SO2處理后葉片CAT活性改變與大麥幼苗的生長趨勢相同，根長與CAT活性顯著相關(guān)（r=0.9790），說明脅迫引起的H2O2積累可能與植株生長抑制有關(guān)。GSH是胞內(nèi)主要的小分子抗氧化劑，其巰基參與氧化還原反應(yīng)，能加速自由基的清除，同時保護(hù)蛋白硫醇基團(tuán)不被氧化、功能穩(wěn)定。本文中各SO2處理組的GSH含量增加了34%46%（圖2），使脅迫組細(xì)胞對活性氧的清除能力顯著增強(qiáng)，胞內(nèi)活性氧的積累減少，從而提高了植物對逆境的耐受性12。GSH-Px以GSH為底物，還原H2O2和烷烴氫過氧化物,減少胞內(nèi)H2O2和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量，以保護(hù)機(jī)體免受損害11

11、。經(jīng)SO2水合物處理后，濃度0.1 mmol L-1以上的各組GSH-Px活性均高于對照，10 mmol L-1組顯著增高，表明SO2脅迫后GSH-Px活性能夠誘導(dǎo)性增高，細(xì)胞可通過增強(qiáng)GSH-Px系統(tǒng)的功能提高對氧自由基的消除能力，從而增強(qiáng)大麥幼苗對SO2脅迫的適應(yīng)性。2.3 外源AsA對SO2水合物處理組大麥幼苗生長和MDA含量的影響AsA作為一種非酶促小分子抗氧化劑，在防御細(xì)胞氧化損傷中具有重要作用。它主要通過APX的催化作用與H2O2反應(yīng)，將H2O2還原為H2O，降低植物細(xì)胞的H2O2含量3，還能與GSH、抗氧化酶一起清除O2-、單線態(tài)氧和OH13，減輕細(xì)胞的氧化脅迫。本研究中，外源A

12、sA預(yù)處理2.5 h后，緩解了SO2水合物處理對大麥植株的生長抑制，降低了葉細(xì)胞中MDA的含量（圖3），說明AsA能提高植物細(xì)胞活性氧清除能力，防止SO2脅迫對膜脂的過氧化及生理毒性。3 討論硫是植物的必需元素，植物主要是通過根系從土壤中吸收硫，部分可來自空氣中的SO2。SO2進(jìn)入細(xì)胞后轉(zhuǎn)化為H+、HSO-3和HSO2-3，直接導(dǎo)致細(xì)胞pH值的降低，影響酶催化活性，從而干擾細(xì)胞的代謝過程；隨后HSO-3和HSO2-3被氧化為SO2-4，該反應(yīng)主要是在光照下由葉綠體產(chǎn)生的O2-啟動的，在此氧化過程中產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）3。植物在受到逆境脅迫時，能通過細(xì)胞內(nèi)的酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)來消除RO

13、S，維持細(xì)胞的正常生理活動。酶促抗氧化體系主要通過SOD、CAT、GSH-Px等多種抗氧化酶，從不同角度、不同環(huán)節(jié)清除ROS。其中，SOD將O2-歧化為H2O2，防止O2-對機(jī)體產(chǎn)生直接和間接的損傷作用；CAT，APX，GSH-Px可催化H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O和O2，阻止H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镺H；GSH-Px還能還原烷烴氫過氧化物11。 圖3 外源AsA對SO2處理組大麥幼苗生長和葉片MDA含量的影響Fig.3 Effect of exogenous AsA on seedlings growth and MDA content in leaves of barley incubated in SO2

14、 hydratesA: 蒸餾水; B: 10 mg L-1 AsA; C: 10 mmol L-1 NaHSO3-Na2SO3; D: 10 mg L-1 AsA+10 mmol L-1 NaHSO3-Na2SO3研究表明，較低濃度的SO2對擬南芥SOD和CAT活性沒有影響，但APX的活性和mRNA量增加14，較高濃度SO2暴露能引起地衣SOD、POD活性改變15。本研究中，SO2水合物處理后大麥葉片SOD、GSH-Px活性誘導(dǎo)性增高，GSH含量上升，說明SO2處理能引起植物細(xì)胞的氧化脅迫，并通過某種途徑（如H2O2信號途徑）誘導(dǎo)某些基因的表達(dá)，以增強(qiáng)植物的逆境適應(yīng)性。加入外源抗氧化劑后能同時

15、緩解SO2對細(xì)胞膜脂的氧化損傷效應(yīng)和生長抑制，進(jìn)一步證明SO2對大麥幼苗的生長抑制與其氧化損傷效應(yīng)有關(guān)。大麥根長、SOD活性等生理指標(biāo)對環(huán)境SO2較為敏感，根長呈劑量依賴性縮短，SOD活性在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性增高，有望作為環(huán)境SO2污染的監(jiān)測指標(biāo)。SO2脅迫導(dǎo)致胞內(nèi)ROS增加，ROS可能誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗逆能力，提高植株的適應(yīng)性；同時，ROS可直接攻擊DNA分子中的堿基和核糖，導(dǎo)致共價鍵斷裂16；ROS還能引起蛋白質(zhì)氧化損傷，使DNA修復(fù)相關(guān)的酶結(jié)構(gòu)和功能異常，DNA損傷不能及時修復(fù)，從而導(dǎo)致姊妹染色單體交換率、染色體斷裂率增大2。姊妹染色單體交換發(fā)生在兩條DNA分子鏈間，

16、可能具有位置效應(yīng)，能改變相鄰基因的表達(dá)方式；而染色體斷裂可能引起必須基因的缺失或突變，會誘發(fā)細(xì)胞異常或死亡,從而減少有絲分裂的細(xì)胞數(shù)目，影響植株的生長。最近我們發(fā)現(xiàn)，SO2暴露能誘發(fā)擬南芥葉細(xì)胞中與逆境適應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)增強(qiáng)，抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性與同工酶譜帶改變17，從轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯水平證實了SO2對植物的氧化脅迫效應(yīng)。4 結(jié)論SO2水合物處理誘使葉細(xì)胞中多種抗氧化酶活性增高、GSH含量增加，說明SO2能引起植物細(xì)胞氧化脅迫，細(xì)胞的氧化損傷可能是其抑制植株生長的原因。加入外源抗氧化劑AsA后，能緩解SO2對大麥幼苗生長的抑制作用，降低膜脂過氧化產(chǎn)物MDA水平，表明SO2對植物的生長

17、抑制與其對細(xì)胞的氧化脅迫有關(guān)，減輕氧化脅迫可以提高植物對SO2的耐受性。參考文獻(xiàn)：1 NOJI M, SAITO M, NAKAMURA M, et al. Cysteine synthase overexpression in tobacco confers tolerance to sulfur-containing environmental pollutantsJ. Plant Physiology, 2001, 126(3): 973-980.2 Yi HuiLan, Liu Jing, Zheng Ke. Effect of sulfur dioxide hydrates expo

18、sure on cell cycle, sister chromatid exchange and micronuclei in barley seedlingsJ. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2005, 62: 421-426.3 錢永常, 余叔文. SO2對植物的氧化作用和植物的抗氧化作用J. 植物生理學(xué)通訊, 1991, 27(5): 326-331.Qian Yongchang, Yu Shuwen. Oxidation of sulfur dioxide on plants and anti-oxidation of plants

19、J. Plant Physiology Communications, 1991, 27(5): 326-331.4 MITTLER R, VANDERAUWERA S, GOLLERY M, et al. Reactive oxygen gene network of plantsJ. Trends in Plant Science, 2004, 9(10): 490-498.5 SHAPIRO R. Genetic effects of bisulfite (sulfur dioxide)J. Mutation Research, 1977, 39: 149-176.6 張志良, 瞿偉菁.

20、 植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)M. 3版. 北京: 高等教育出版社, 2003.Zhang Zhiliang, Qu Weijing. Experimental Instruction of Plant PhysiologyM. 3rd ed. Beijing: Higher Education Press, 2003.7 鄒琦. 植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)M. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000: 168-170.Zou Qi. Guidance of Plant Physiology and Biochemistry ExperimentationM. Beijing: Chinese Agricultur

21、al Press, 2000: 168-170.8 FLOH L, GNZLER W A. Assay of glutathione peroxidaseJ. Methods in Enzymology, 1984, 105: 114-120.9 ELLMAN G L. Tissue sulfhydryl groupsJ. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959, 82(1): 70-77.10 王建華, 劉鴻先. 超氧物歧化酶（SOD）在植物逆境和衰老生理中的作用J. 植物生理學(xué)通訊, 1989 (1): 1-7.Wang Jianhua,

22、 Liu Hongxian. The role of superoxide dismutase (SOD) in stress physiology and senescence physiology of plantJ. Plant Physiology Communications, 1989 (1): 1-7.11 GECHEV T, WILLEKENS H, MONTAGU M V, et al. Different responses of tobacco antioxidant enzymes to light and chilling stressJ. Journal of Pl

23、ant Physiology, 2003, 160(5): 509-515.12 陳坤明, 宮海軍, 王鎖民. 植物谷胱甘肽代謝與環(huán)境脅迫J. 西北植物學(xué)報, 2004, 24(6): 1119-1130.Chen Kunming, Gong Haijun, Wang Suoming. Glutathione metabolism and environmental stresses in plantsJ. Acta Botanica BorealiOccidentalia Sinica, 2004, 24(6): 1119-1130.13 Huang Chenghong, He Wenlia

24、ng, Guo Jinkui, et al. Increased sensitivity to salt stress in an ascorbate-deficient Arabidopsis mutantJ. Journal of Experimental Botany, 2005, 56(422): 3041-3049.14 KUBO A, SAJI H, TANAKA K, et al. Expression of Arabidopsis cytosolic ascorbate peroxidase gene in response to ozone or sulfur dioxide

25、J. Plant Molecular Biology, 1995, 29(3): 479-489.15 KONG F X, HU W, CHAO S Y, et al. Physiological responses of the lichen Xanthoparmelia mexicana to oxidative stress of SO2J. Environmental and Experimental Botany, 1999, 42: 201-209.16 Pan Jianwei, Zheng Ke, Ye Dan, et al. Aluminum-induced ultraweak

26、 luminescence changes and sister-chromatid exchanges in root tip cells of barleyJ. Plant Science, 2004, 167: 1391-1399.17 李利紅. 二氧化硫?qū)M南芥保護(hù)酶活性及基因表達(dá)的影響D. 太原: 山西大學(xué), 2008: 30-43.Li Lihong. Effect of sulfur dioxide on protective enzymes activity and gene expression in Arabidopsis thalianaD. Taiyuan: Shanx

27、i University, 2008: 30-43.Oxidative damage induced by sulfur dioxide in barley seedlingsYi Huilan , Li Xiujuan , Liu JingSchool of Life Science and Technology, Shanxi University, Taiyuan 030006, ChinaAbstract: Effects of sulfur dioxide (SO2) hydrates on seedling growth and antioxidant enzymes activi

28、ties were investigated in barley (Hordeum vulgare L.). A mixture of sodium bisulphite and sodium sulfite (1:3, mmol L-1: mmol L-1, pH 7.0), at various concentrations from 0.10 to 10 mmol L-1, was used for the treatments. The results showed that seedling growth was dependent on treatment concentrations and duration. The inhibition of root and shoot growth occurred in concentration- and period- dependent manners after seedlings exposed to the hydrates at concentrations of 2.5 to 10.0 mmol L-1, while the inhibition on root growth is stronger than that on shoot. Howeve