質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后luciferase檢測 操作手冊

1、 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后luciferase檢測 操作手冊實驗流程描述培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞分入24-well培養(yǎng)板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染當(dāng)天按實驗設(shè)計的組別進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染24小時后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記基因（如GFP）的表達情況，然后使用“Dual-Glo Luciferase Assay System（E2920，promega）”試劑盒處理細(xì)胞、進行l(wèi)uciferase表達檢測。實驗材料：試劑試劑名稱試劑來源cat.No.胎牛血清 FBSGIBCODMEMGIBCO胰酶上?；瘜W(xué)試劑公司Opti-MEMInvitrogenDual-Glo Luciferase Ass

2、ay SystempromegaE2920儀器儀器名稱儀器來源cat.No.熒光顯微鏡奧林帕斯micropublisher 3.3RTVCO2培養(yǎng)箱日本三洋 SANYOMCO-175生物安全柜上海振樣創(chuàng)空氣凈化設(shè)備公司 Bio 1200-A2酶標(biāo)儀睿星公司提供實驗步驟：1. 準(zhǔn)備目的細(xì)胞1.1 細(xì)胞復(fù)蘇1) 從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管2) 迅速放入37水浴中，并不時搖動使其盡快解凍3) 完全解凍后，1000 rpm，離心2 min4) 75%酒精擦拭凍存管消毒后，移至超凈臺5) 吸去凍存液上清，加入1 ml 新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種至含有3 ml完全培養(yǎng)基的6-cm dish中，

3、輕輕晃勻后置于37、5%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)6) 次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)1.2 細(xì)胞傳代1) 將生長至90%匯合的細(xì)胞進行傳代2) 棄去舊培養(yǎng)液，加入2 ml滅菌的D-Hanks溶液，洗滌細(xì)胞生長面，然后棄去該溶液3) 加入1 ml胰酶消化液，37消化約1-2 min，直到細(xì)胞完全消化下來4) 加入完全培養(yǎng)基2ml，用刻度吸管吹打數(shù)次，將壁上的細(xì)胞沖洗下來5) 混勻細(xì)胞后分至兩個新的6-cm dish 中，補足完全培養(yǎng)基至4ml，繼續(xù)培養(yǎng)2. 目的細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染1) 將處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞進行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液2) 將細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為4×105）接種于24-wel

4、l培養(yǎng)板中，37、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達到約80%3) 根據(jù)invitrogen lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明書進行轉(zhuǎn)染操作：a) 將培液換成400 µl的opti-MEM培養(yǎng)基b) 每孔轉(zhuǎn)染1 µg質(zhì)粒、需要2 µl lipofectamine 2000，按照此比例，將質(zhì)粒和lipofectamine 2000分別溶解于opti-MEM中，混勻，室溫靜置5 minc) 將b) 中稀釋好的質(zhì)粒和lipofectamine 2000混勻，室溫靜置 20 mind) 把質(zhì)粒DNA與Lipofectamine 2000的混合液加入 2

5、93T 細(xì)胞中，37 5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時后，換成新鮮的含10%血清的完全培養(yǎng)基4) 轉(zhuǎn)染24小時后觀察質(zhì)粒上熒光標(biāo)記基因的表達情況以判斷轉(zhuǎn)染效率，同時該過程用來平衡培養(yǎng)體系至室溫下3. luciferase檢測1) 初次使用Dual-Glo Luciferase Assay kit時，需要將Dual-Glo® Luciferase Buffer和Dual-Glo® Stop & Glo® Buffer提前數(shù)天放于室溫下平衡；將Dual-Glo® Luciferase Buffer完全加入到Dual-Glo® Lucifera

6、se Substrate瓶中，完全溶解底物，形成Dual-Glo® Luciferase Reagent，分裝保存于-702) 24孔板中每孔去除250µl培養(yǎng)基，加入剩余體積同等量（即250µl）的Dual-Glo® Luciferase Reagent，室溫反應(yīng)10min以待細(xì)胞充分裂解，吹打混勻轉(zhuǎn)移至1.5mL ep管中3) 根據(jù)需要的量配制Dual-Glo® Stop & Glo® Reagent待用（該試劑必須現(xiàn)配現(xiàn)用），如配制1.1mL Dual-Glo® Stop & Glo® Rea

7、gent，即取11µl Dual-Glo® Stop & Glo® Substrate加入到1089µl Dual-Glo® Stop & Glo® Buffer中4) 吸取100µl步驟2) 中的細(xì)胞裂解液 100µl于Lockwell maxisorp檢測板中，酶標(biāo)儀檢測firefly luminescence（螢火蟲熒光酶熒光值），該步驟在細(xì)胞經(jīng)Dual-Glo® Luciferase Reagent裂解反應(yīng)10min-2hours之內(nèi)完成5) 檢測firefly luminescence后，再在每孔中加入50µl Dual-Glo® Stop & Glo® Reagent，室溫反應(yīng)，在10min-2hours之內(nèi)完成Renilla luminescence（海腎熒光酶熒光值）的檢測，該檢測時間點距Dual-Glo® Sto