ELISA方法診斷隱孢子蟲抗原

1、單抗介導(dǎo)的夾心ELISA方法的建立摘要：將純化的隱孢子蟲卵囊制備免疫原，經(jīng)油相苗、水相苗共6次免疫，制備了兔抗安氏隱孢子蟲抗體。提純后用HRP標(biāo)記IgG抗體，標(biāo)記后的HRP濃度為1.4 mg/mL，IgG濃度為1.755 mg/mL，酶/抗體摩爾比為1.18。選用3B10單抗與酶標(biāo)兔抗建立了夾心ELISA試驗(yàn)，單抗的最佳稀釋度為1：200，酶標(biāo)抗體的工作濃度為1：400800。在3種待檢樣品的處理方法中，以樣品經(jīng)超聲波破碎后置液氮-37反復(fù)凍融后再檢測(cè)，效果最好；乙醚脫脂處理后再同上處理，結(jié)果OD值稍低；未經(jīng)凍融處理的隱孢子蟲卵囊液比同滴度的處理樣品OD值顯著偏低。夾心ELISA最低檢出限為含

2、100個(gè)卵囊/mL糞樣。特異性試驗(yàn)表明：該方法對(duì)于同屬于隱孢子蟲屬的豬小球隱孢子蟲、鴕鳥隱孢子蟲有較高的識(shí)別力，其OD值與牛C. andersoni接近,而卵囊濃度相同的雞球蟲和豬等孢球蟲的OD值則顯著偏低。 引 言目前，隱孢子蟲的診斷方法主要有直接鏡檢、染色鏡檢、免疫學(xué)方法(如ELISA和IFAT)及PCR方法等。目前研究較多的是免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。1990年Robert報(bào)道了檢測(cè)牛糞便中卵囊抗原的ELISA方法，取得了較好的效果。目前，國(guó)外已有商品ELISA檢測(cè)試劑盒。國(guó)內(nèi)張西臣1996年報(bào)道了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)病原的初步研究，尹繼剛應(yīng)用雙夾心-ELISA對(duì)60份牛糞便樣本檢

3、查,并與抗酸染色法比較發(fā)現(xiàn), ELISA敏感性比抗酸染色強(qiáng)，且不與牛球蟲、結(jié)腸小袋蟲發(fā)生類屬反應(yīng)。作者在前兩個(gè)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，初步進(jìn)行了夾心ELISA試驗(yàn)，為今后制備診斷試劑盒，用于水源、環(huán)境中隱孢子蟲的檢測(cè)做前期的準(zhǔn)備。1.材料與方法1.1材料抗牛源安氏隱孢子蟲的單克隆抗體制備見實(shí)驗(yàn)二，使用的為其中的3B10單抗，上清效價(jià)為6400，腹水效價(jià)為102400。多抗為兔抗牛源安氏隱孢子蟲抗體，瓊擴(kuò)效價(jià)為1：8。酶標(biāo)單抗和酶標(biāo)多抗均為自己標(biāo)記。酶標(biāo)羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中山金橋生物公司。健康無(wú)隱孢子蟲的雄兔和雌兔各一只，購(gòu)自中牟縣某養(yǎng)兔場(chǎng)，各種隱孢子蟲、球蟲、豬等孢球蟲均為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。試劑及器材:

4、(1)0.1M NaIO：稱取241mg高碘酸鈉(上海浦東化學(xué)試劑廠 20010523)溶于蒸餾水10mL中。(2)1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液:0.2M NaAc(天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心 20031107) (1.361克50mL) 3.7mL0.2M HAc (0.601mL50mL) 6.3mL加蒸餾水至2,000mL。(3)0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:NaCO 0.32克NaHCO 0.586克加蒸餾水至50mL再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。(4)NaBH（FLUKA進(jìn)口分裝 20040726）溶液(4mgmL):臨用時(shí)稱取NaBH4mg

5、溶于1mL蒸餾水中。(5)0.01M PH7.4 PBS。(6)PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。(7)萘氏試劑(8)純化的兔抗牛安氏隱孢子蟲IGg抗體。(9)HRP(上海雪滿生物科技有限公司20041228， RZ>3.0，酶活力：300u以上/mg)。(11) 攪拌器，分光光度計(jì)，離心機(jī)。(12) 透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。1.2方法隱孢子蟲抗原，采自西郊某奶牛場(chǎng)陽(yáng)性牛，經(jīng)蔗糖濃度梯度離心純化后，用PBS調(diào)整卵囊濃度為2×108個(gè)/mL左右。將上述提純卵囊置超聲波細(xì)胞粉碎儀上以80%的功率粉碎6分鐘，然后將粉碎物置液氮和和37凍融5-6次，經(jīng)3500rmi

6、n-1離心10分鐘，測(cè)定上清中性液蛋白含量，可溶性抗原用于抗體檢測(cè)，使用部分可溶性抗原和全部沉淀（非可溶性抗原）制備免疫原。將上述抗原的一部分（凍融的上清和破碎的卵囊碎片）混合物加2倍量的弗氏完全佐劑乳化制成油苗。另一部分不加油佐劑，作為水苗。免疫，首先用油苗免疫，每只兔子免疫1mL,背部皮下多點(diǎn)注射和腹腔注射相結(jié)合。免疫兔用全價(jià)飼料飼養(yǎng)于清潔動(dòng)物房?jī)?nèi)。免疫兔從頸靜脈放血，血液置于滅菌平皿中，于37自然析出血清。兔抗牛安氏隱孢子蟲IGg抗體的提純 參照實(shí)驗(yàn)二的方法提純和測(cè)定兔抗體的濃度。 IgG抗體的標(biāo)記參照董邦全54的方法略加改進(jìn)，標(biāo)記步驟如下：(1)稱取5mgHRP溶解于1mL雙蒸水中。(

7、2)于上液中加入0.2mL新配的0.1M NaIO溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。(3)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4過(guò)夜。(4)加20l 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化的HRP的PH升高到9.09.5，然后立即加入含適量IgG的1mL 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)。(5)加0.1mL新配的4mgmL NaBH液，混勻，再置42小時(shí)。(6)將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.01M PH7.4 PBS透析，4過(guò)夜。(7)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置41小時(shí)。(8)3000rmin-1離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二

8、次，最后沉淀物溶于少量0.01M PH7.4的PBS中。(9)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.01M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，4500rmin-1離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。結(jié)果判定：IgG量(mgmL)(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62工作濃度的選擇55 先將抗原用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10gmL左右，酶標(biāo)板內(nèi)，每孔100l，4過(guò)夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。用1%的BSA封閉（37孵育1小時(shí)）洗滌3次。酶標(biāo)記抗體用0.01M的PBS液依次稀釋成1100，1200，140

9、0，1800，11600(根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定)，分別加入反應(yīng)孔中，每個(gè)稀釋度4-8孔，每孔100ul，37孵育1小時(shí)后洗滌。然后加底物溶液，每孔100ul，室溫1015分鐘。以2M HSO 50ul終止反應(yīng)。檢測(cè)樣品的制備標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性糞樣，采自糞檢陽(yáng)性牛場(chǎng)；標(biāo)準(zhǔn)陰性糞樣，為糞便集蟲后，顯微鏡下檢驗(yàn)看不到卵囊，即為陰性的牛糞；交叉反應(yīng)糞便，僅有雞球蟲的雞糞樣、豬等孢球蟲的豬糞樣、有牛小球隱孢子蟲感染的牛糞、有鴕鳥隱孢子蟲的鴕鳥糞樣等。將這些糞樣用0.01M的PBS稀釋后過(guò)濾，參照粗提卵囊的方法處理這些樣品。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性卵囊樣品在計(jì)數(shù)后，稀釋成不同的濃度，進(jìn)行凍融、破碎、或乙醚除脂等處理后用于實(shí)驗(yàn)。用0

10、.05M PH9.6包被緩沖液適當(dāng)稀釋兔抗/單抗 (),于微量酶標(biāo)板每孔加100,置4過(guò)夜后,用PBS-T洗滌液洗3次。用1%的BSA封閉（37孵育1小時(shí)），洗滌3次甩干。每孔加待測(cè)樣品100l,同時(shí)設(shè)陰性和試劑空白對(duì)照,放置37反應(yīng)1,用0.0MPBS-T洗液洗滌3次。每孔加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗體1001置37反應(yīng)1,用洗滌液洗滌5次。每孔加底物溶液100,室溫暗處放置1015顯色,每孔加終止反應(yīng)液50。然后在酶標(biāo)測(cè)定儀上測(cè)定450處的值。以樣品孔的值()與陰性對(duì)照孔的值()之比大于2(即/>2.1)時(shí)定為陽(yáng)性。通過(guò)點(diǎn)陣分析法確定用于檢測(cè)一定濃度抗原所需抗體()和酶標(biāo)抗體的工作濃度。將兔抗

11、體/單抗()濃度分別稀釋成不同濃度，蟲卵濃度分別為107、106、105、104、103和102個(gè)/，酶標(biāo)抗體也配成不同的稀釋度。在工作濃度選擇中,以/>2.1時(shí),兔抗體/單抗()濃度最低、酶標(biāo)抗體稀釋度最高為最適條件。對(duì)1份豬等孢球蟲卵囊而無(wú)隱孢子蟲卵囊的豬糞樣，有小球隱孢子蟲卵囊而無(wú)球蟲的牛糞，有雞球蟲糞樣、有鴕鳥隱孢子蟲的鴕鳥糞樣按前述方法處理后進(jìn)行ELISA檢測(cè)。 對(duì)若干含隱孢子蟲的牛糞樣分別進(jìn)行抗酸染色和ELISA檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。對(duì)相同樣品分次進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果的一致與否。 2.結(jié)果與分析2.1兔抗牛源安氏隱孢子蟲抗體的制備與標(biāo)記抗原制備兩種，第一種制成油苗后含可

12、溶性抗原1.2mg/mL,顆粒性抗原6.5×107個(gè)/mL。第二種抗原未加免疫油佐劑，顆粒性抗原1×108個(gè)/mL，可溶性抗原1.24mg/mL。實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)表5所示的6次免疫后，合計(jì)共免全卵囊（超聲破碎混合物）數(shù)為3.5×108個(gè)/只。第6次免疫后15天時(shí)測(cè)定血清抗體瓊擴(kuò)效價(jià)為1：8，此時(shí)采血制備血清，按實(shí)驗(yàn)二中辛酸硫酸銨法提純IgG，測(cè)定其蛋白含量為18.49mg/mL。表5.實(shí)驗(yàn)兔的免疫途徑及免疫劑量Tab5. The vaccine dosage, usage of immunized rabbit免疫次數(shù)immune-time免疫途徑usage劑量（mL/只

13、）dosage間隔時(shí)間（天）interval抗原量(個(gè)/mL) antigen quantities1皮下多點(diǎn)注射1（油乳苗）146.5×1072皮下多點(diǎn)注射1（油乳苗）146.5×1073皮下多點(diǎn)注射1（油乳苗）146.5×1074腹部皮下/腹腔注射0.5（水乳苗）105×1075腹部皮下/腹腔注射0.5（水乳苗）75×1076腹部皮下/腹腔注射0.5（水乳苗）5×107將上述提純的抗體分兩次標(biāo)記HRP，測(cè)定第二次的酶結(jié)合物中HRP濃度為1.4 mg/mL，IgG濃度為1.755 mg/mL，酶/抗體摩爾比為1.18。均在合適的濃度

14、范圍內(nèi)。2. 2酶標(biāo)記抗體的工作濃度的選擇 將新制備的抗原（新）稀釋10g/mL、5g/mL分別包被酶標(biāo)板,以前制備的抗原（原）按1:100包被板子,4過(guò)夜后用PBS-T洗滌三次,每次2分鐘,加入不同稀釋度的酶標(biāo)兔抗隱孢子蟲抗體,置37作用1小時(shí),加入底物溶液后置室溫顯色1015分鐘,終止反應(yīng),酶標(biāo)儀讀數(shù)。結(jié)果見表6,表7。表6.酶標(biāo)1號(hào)抗體的工作濃度選擇.Tab6.The selection of antibodyseemLy dilution抗原的濃度 不同稀釋倍數(shù)的酶標(biāo)抗體OD值A(chǔ)ntigen dilution HRP-antibody OD value of the different

15、 dilution multiple 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 1:51200 1:102400新5g/mL0.644 0.604 0.575 0.495 0.337 0.260 0.188 0.131 0.095 0.074 0.050 0.621 0.576 0.536 0.444 0.331 0.257 0.183 0.122 0.092 0.072 0.050新10g/mL0.75 0.562 0.477 0.376 0.305 0.199 0.132 0.108 0.087 0.074 0

16、.057 0.75 0.526 0.464 0 .334 0.265 0.184 0.124 0.097 0.075 0.061 0.051原1:100 1.033 0.970 0.823 0.840 0.734 0.594 0.433 0.376 0.181 0.159 0.101 1.110 1.063 0.838 0.599 0.628 0.625 0.346 0.424 0.172 0.162 0.134 1.066 0.888 0.852 0.669 0.655 0.487 0.052 0.046 0.047 0.046 0.035 表7.酶標(biāo)2號(hào)抗體的工作濃度選擇Tab7.The

17、selection of antibodyseemLy dilution抗原的濃度 不同稀釋倍數(shù)的酶標(biāo)抗體OD值A(chǔ)ntigen dilution HRP-antibody OD value of the different dilution multiple 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 1:51200 1:102400新5g/mL. 0.831 0.711 0.702 0.635 0.607 0.579 0.565 0.437 0.311 0.218 0.057 0.3740.052 0.741 0.

18、672 0.749 0.639 0.607 0.533 0.460 0.315 0.219 0.064 0.548新10g/mL 0.724 0.664 0.679 0.639 0.579 0.535 0.437 0.334 0.248 0.149 0.056 0.606 0.057 0.692 0.667 0.619 0.594 0.515 0.444 0.341 0.228 0.148 0.057 0.461原1:100 1.244 0.840 0.889 0.919 0.744 0.630 0.618 0.561 0.502 0.433 0.309 0.903（+） 1.290 1.08

19、1 1.102 0.953 0.878 0.776 0.686 0.619 0.555 0.465 0.344 1.345（+） 1.140 1.164 1.177 0.998 0.877 0.767 0.710 0.643 0.552 0.468 0.338 1.434（+）由上述兩表可見：酶標(biāo)1號(hào)抗體的工作濃度為：1：200400，2號(hào)抗體的工作濃度為1：400800為合適的工作濃度。將兩標(biāo)記物各加50%甘油，分別混勻后分裝，放-20保存?zhèn)溆谩?.3不同處理方法對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的影響將待檢樣品分別做以下處理：1.粗提后不加處理，2.經(jīng)超聲波破碎后反復(fù)凍融處理，3.經(jīng)乙醚除脂后再破碎凍融。分別

20、將以上方法處理的樣品根據(jù)卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果分別配成不同稀釋度的檢樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表8。在合適的條件下（抗體包被濃度10g/mL，二抗工作濃度為1：800時(shí)），樣品經(jīng)超聲波破碎后加液氮-37反復(fù)凍融后再檢測(cè)，效果最好；乙醚處理后再同上處理，結(jié)果OD值稍低；未經(jīng)處理的隱孢子蟲卵囊液比同滴度的處理樣品OD值顯著偏低。表8.不同處理方法對(duì)檢樣的測(cè)定結(jié)果的影響Tab8. The influence of the different processing to result包被 酶標(biāo) 不同方法處理的樣品濃度 抗體 the sample of the different processingcoating HR

21、P-AB 未處理隱孢子蟲樣品 破碎反復(fù)凍溶的樣品 乙醚+破碎反復(fù)凍溶的樣品 dilution unhandled sample sonicate +freeze-thaw ethyl ether+ sonicate +freeze-thaw g/mL 106 105 104 103 5×106 5×105 5×104 5×103 5×106 5×105 5×104 5×10310 1：800 0.262 0.153 0.116 0.116 0.727 0.556 0.262 0.195 0.629 0.492 0.

22、185 0.1291：400 0.158 0.107 0.096 0.095 0.651 0.177 0.199 0.117 0.527 0.395 0.145 0.1071 1：800 0.202 0.102 0.092 0.099 0.524 0.270 0.140 0.105 0.295 0.198 0.111 0.128 1：400 0.114 0.078 0.087 0.096 0.535 0.216 0.113 0.131 0.218 0.144 0.119 0.150表9.不同單抗包被的夾心ELISA檢測(cè)結(jié)果Tab9. The results of different McAbs

23、 coating in Sandwich ELISA單抗名稱 不同抗原含量樣品的OD值McAb name The OD value of the different antigen 1：100 1：400 1：1600 1：6400 1：25600 1：1024001A3 0.369 0.276 0.274 0.278 0.270 0.268 3B10 0.566 0.561 0.495 0.472 0.485 0.5283F4 0.265 0.233 0.191 0.181 0.178 0.1704B3 0.585 0.369 0.304 0.268 0.248 0.2682.4不同單抗的E

24、LISA 效果試驗(yàn) 將腹水1：50稀釋后包被酶標(biāo)板，放4過(guò)夜。用1.5%的明膠封閉371小時(shí)。加處理過(guò)的抗原1.0×108個(gè)/mL，可溶性抗原濃度：1.24mg/ mL。按1：100，1：400，1： 1600，1：6400，1：2560，1：102400加入。按測(cè)定的酶標(biāo)抗體的工作濃度加入酶標(biāo)抗體。加入二抗，顯色-終止讀數(shù)（結(jié)果見表9）。結(jié)果在同等條件下五株單抗以4B3的吸附效果好，且不同卵囊量的樣品OD值有一定的梯度,又因其酶標(biāo)效價(jià)也較高，就選用該單抗與酶標(biāo)兔抗作夾心ELISA試驗(yàn)。 將單抗作不同的稀釋度，與不同濃度的抗原反應(yīng)，結(jié)果見表10。當(dāng)單抗1：200、抗原1：5000稀釋

25、時(shí)的OD值為0.211，與陰性比較值大于2.1，為陽(yáng)性，將1：200定為單抗的最佳稀釋度。表10.不同稀釋度單抗與酶標(biāo)多抗的夾心ELISA結(jié)果 Tab10.The result of different dilution of McAb and HRP- Multiple-antibody in ELISA單抗稀釋度 不同稀釋度抗原的OD值 McAb dilution The OD value of the different antigen 1：100 1：500 1：2000 1：5000 - 1：200 0.500 0.312 0.240 0.211 0.0911：600 0.447 0

26、.281 0.220 0.194 0.0781：1800 0.367 0.267 0.209 0.197 0.069將單抗與多抗稀釋成不同的濃度包被酶標(biāo)板，以不同處理的隱孢子蟲抗原適當(dāng)稀釋后加入酶標(biāo)板中吸附，再用酶標(biāo)記的兔抗牛安氏隱孢子蟲抗體反應(yīng)后讀數(shù)。比較結(jié)果見表11、表12。在以10ug/mL濃度包被時(shí)，多抗對(duì)隱孢子蟲卵囊抗原的識(shí)別能力較強(qiáng)，處理過(guò)的抗原在5000個(gè)/mL時(shí)OD仍達(dá)到0.7以上，但整個(gè)稀釋系列的結(jié)果差別不大，即呈現(xiàn)明顯的非特異反應(yīng)；而單抗在這個(gè)包被濃度對(duì)處理抗原的識(shí)別力低，但敏感性增強(qiáng)，OD值與抗原稀釋度之間呈明顯的負(fù)相關(guān)。比較二者在較低的包被濃度時(shí)，得到類似的結(jié)果。表11

27、.兔抗牛安氏隱孢子蟲抗體鋪底的夾心ELISA結(jié)果Tab11.The results of Multiple-antibodies of rabbits coating in ELISA包被 酶標(biāo) 不同方法處理的樣品濃度 抗體 the sample of the different processingcoating HRP-AB 未處理隱孢子蟲樣品 破碎反復(fù)凍溶的樣品 乙醚+破碎反復(fù)凍溶的樣品 dilution unhandled sample sonicate +freeze+ thaw ethyl ether+ sonicate +freeze +thawg/mL 106 105 104

28、103 5×106 5×105 5×104 5×103 5×106 5×105 5×104 5×10310 1：800 0.736 0.696 0.400 0.319 0.667 0.687 0.688 0.640 0.723 0.782 0.765 0.753 1：400 0.686 0.624 0.297 0.277 0.749 0.690 0.716 0.659 0.765 0.735 0.652 0.7071 1：800 0.593 0.444 0.219 0.325 0.748 0.677 0.682 0

29、.626 0.733 0.646 0.584 0.568 1：400 0.533 0.415 0.198 0.266 0.676 0.590 0.605 0.542 0.662 0.616 0.546 0.551 表12.單抗(4B3)+兔抗牛安氏隱孢子蟲抗體夾心ELISA結(jié)果Tab12.The results of McAb (4B3) coating in ELISA包被 酶標(biāo) 不同方法處理的樣品濃度 抗體 the sample of the different processingcoating HRP-antibody 未處理隱孢子蟲樣品 破碎反復(fù)凍溶的樣品 乙醚+破碎反復(fù)凍溶的樣品

30、dilution unhandled sample crushing +freeze+ thaw ethyl ether+ crushing +freeze +thawg/mL 106 105 104 103 5×106 5×105 5×104 5×10 3 5×106 5×105 5×104 5×10310 1：800 0.262 0.153 0.116 0.116 0.727 0.556 0.262 0.195 0.629 0.492 0.185 0.1291：400 0.158 0.107 0.096 0.0

31、95 0.651 0.177 0.199 0.117 0.527 0.395 0.145 0.1071 1：800 0.202 0.102 0.092 0.099 0.524 0.270 0.140 0.105 0.295 0.198 0.111 0.128 1：400 0.114 0.078 0.087 0.096 0.535 0.216 0.113 0.131 0.218 0.144 0.119 0.150表13.夾心ELISA的特異性試驗(yàn)Tab13.The specific test of Sandwich ELISA樣品 牛安氏C.P 雞球蟲 豬等孢球蟲 豬小球隱孢子蟲 鴕鳥隱孢子蟲

32、陰性對(duì)照samples bovine chicken Isospora pig Ostrich negative C. andersoni coccidium suis C. parvum Cryptosporidium contrl濃度（個(gè)/mL） 10000 10000 10000 10000 10000 無(wú) OD值 0.538 0.197 0.236 0.621 0.498 0.097 2.4夾心ELISA的特異性試驗(yàn)將含有雞球蟲、豬等孢球蟲、豬小球隱孢子蟲、鴕鳥隱孢子蟲的糞樣粗提后，配成各含卵囊10000個(gè)/mL的濃度再做反復(fù)凍融處理，與同法制備的同濃度牛安氏隱孢子蟲的樣品同板檢測(cè)，各

33、樣品的OD值如下表13。結(jié)果可見，對(duì)于同屬于隱孢子蟲屬的豬小球隱孢子蟲、鴕鳥隱孢子蟲有較高的識(shí)別力，其OD值與牛C. andersoni接近,而卵囊濃度相同的雞球蟲和豬等孢球蟲的OD值則顯著偏低。2.5敏感性試驗(yàn)通過(guò)對(duì)7份隱孢子蟲含量不同的牛糞樣分別進(jìn)行ELISA檢測(cè)和抗酸染色的結(jié)果表明：夾心ELISA最低能檢出含100個(gè)卵囊/mL糞樣為陽(yáng)性，而同一份樣品所制的五個(gè)抗酸染色玻片有四個(gè)都檢不到卵囊。2.5重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)同一樣品分次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，OD值在每次測(cè)定之間差別不大，說(shuō)明該方法重復(fù)性好。3.結(jié)論與討論3.1抗體制備與標(biāo)記一般要求標(biāo)記的抗體活性高,效價(jià)高(最低116),純度高，親和力好，然后

34、還要具備高質(zhì)量HRP，這是保證標(biāo)記物效價(jià)高，免疫活性好的首要條件。因?yàn)殡[孢子蟲卵囊個(gè)體較大，抗原成分復(fù)雜，直接用于免疫其抗原性還不如病毒和細(xì)菌。免疫印跡試驗(yàn)表明，自然感染動(dòng)物血清識(shí)別較好有效的有效抗原為凍融出的水溶性抗原，但單純使用水溶性抗原免疫效果不好。我們本次使用的兔抗體經(jīng)三次油乳劑苗和三次水相苗免疫，而且全部為全卵囊破碎凍融后的混合物制備的，歷時(shí)兩個(gè)多月，瓊擴(kuò)效價(jià)才達(dá)到1：8。經(jīng)提純后，IgG的純度和濃度提高了，標(biāo)記后的抗體效價(jià)達(dá)到檢測(cè)的要求。標(biāo)記抗體時(shí)，標(biāo)記時(shí)所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴(yán)格掌握。所用試劑，最好(或必需)新鮮配制，室溫?cái)嚢钑r(shí)須要求避光，室內(nèi)溫度一般在20以上為宜。否

35、則會(huì)影響標(biāo)記效果。我先期標(biāo)記單抗時(shí)，就因?yàn)樯鲜鰩醉?xiàng)指標(biāo)沒有嚴(yán)格把握而導(dǎo)致標(biāo)記效率低，酶標(biāo)抗體效價(jià)偏低而影響使用。3.2樣品凍融處理提高檢測(cè)效果以往報(bào)道的ELISA檢測(cè)方法，樣品要經(jīng)福爾馬林-醋酸乙酯、蔗糖液或飽和鹽水等漂浮處理，也有報(bào)道53使用含EDTA的PBS液過(guò)濾后直接檢測(cè)，且不影響檢測(cè)效果。本試驗(yàn)采用蔗糖漂浮法初步提純，以除去糞便中大量的雜質(zhì)，而后根據(jù)卵囊中的水溶性抗原更易被抗體識(shí)別的特點(diǎn)進(jìn)行凍融處理，爾后進(jìn)行檢測(cè)，減少了非特異性的反應(yīng)，提高了檢出率。是否有更為簡(jiǎn)便、有效、可靠的處理方法還有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)摸索。在檢測(cè)糞樣時(shí)，一定要破碎、凍融數(shù)次后才能用于測(cè)試。3.3單抗的種屬特異性本試

36、驗(yàn)所用的單抗可以檢出多種隱孢子蟲，表明不同種的隱孢子蟲具有共同抗原。本試驗(yàn)的建立的方法不僅可以檢查牛安氏隱孢子蟲，也可以檢測(cè)駝鳥隱孢子蟲、雞貝氏隱孢子蟲、豬小球隱孢子蟲，張西臣等用小球隱孢子蟲的單抗建立雙抗夾心-ELISA方法，檢測(cè)兔糞便中、牛糞便中隱孢子蟲卵囊抗原，該方法不僅能檢出小球隱孢子蟲還能檢出鼠隱孢子蟲。表明試驗(yàn)中所采用的單抗是針對(duì)兩種蟲體的卵囊壁的抗原決定基。在這點(diǎn)上與我們的試驗(yàn)結(jié)果相似。3.4隱孢子蟲的診斷方法目前常用的隱孢子蟲診斷方法主要有直接鏡檢法、抗酸染色法、免疫學(xué)方法、及PCR方法等。直接鏡檢法存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢出率低的弊病，而且需要觀測(cè)者有一定的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)；抗酸染色法掌握不好會(huì)出現(xiàn)著染過(guò)淺、過(guò)深和非特異性染色等情況出現(xiàn)；免疫學(xué)方法特異性強(qiáng)，靈敏度高、穩(wěn)定性好，易于掌握，特別是單抗的應(yīng)用使得這些免疫學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)更為突出。常用的免疫學(xué)方法主要有：免疫印跡（Westren-blotting）、免疫酶染色（IEST）、間接血凝（HI）、流式細(xì)胞免疫檢測(cè)（FC