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文檔簡介

1、心肌表達和的改變對糖尿病大鼠缺血再灌注損傷的影響【摘要】 測定不同周期鏈脲佐菌素()誘導糖尿病大鼠心肌表達、變化及其對缺血再灌注()損傷的影響。 【方法】 阻斷和開放左冠狀動脈前降支建立大鼠急性心肌 模型,用 染色,測定大鼠心肌 后梗死面積;免疫印跡分析測定心肌表達;形態(tài)測定()法測定硝基酪氨酸(,)的水平;用硝酸還原酶法測定含量?!窘Y果】 在 處理后周,糖尿病組()心肌梗死面積比相應周期對照組()明顯縮小,處理后周(),梗死面積比相應對照組()增加;內(nèi)皮一氧化氮合酶()在心肌的表達在 比 組增加,然而在 比 明顯減少;超氧亞硝酸根離子(,-)生成的標志性產(chǎn)物硝基酪氨酸( ,) 在 組中較 組

2、低約,但在 組中較 組顯著增加;血一氧化氮( ,)水平 組中較 組增高, 但是 組較 組顯著減少?!窘Y論】 誘導糖尿病早期、晚期對心肌 損傷呈現(xiàn)相反的作用。這可能是由于早、晚期糖尿病相反的心肌 表達及 改變而引起的。 【關鍵詞】 糖尿病 心肌 缺血 再灌注 內(nèi)皮一氧化氮合酶 一氧化氮 硝基酪氨酸 : 【】 - () - () 【】 () - (); ; ; 【】 , () - (); (), ; , ; - 【】 - - , : ; ; ; ; ; 鏈脲佐菌素(,) 誘導的糖尿病動物模型在心肌缺血再灌注(,)損傷的實驗研究呈現(xiàn)出矛盾的結果,包括減輕或增加心肌 損傷。引人注意的是 實驗時的心肌保

3、護作用,類似于缺血預適應(,)反應,其保護機理仍未完全明了。研究發(fā)現(xiàn),一氧化氮(,)是血管內(nèi)皮細胞生存和心肌保護因子,具有抑制細胞凋亡的作用,攝入 供體可減輕 損傷。由內(nèi)皮一氧化氮合酶( ,)催化-精氨酸(-,-)合成。缺血再灌注時,超氧陰離子(,)快速形成,并與反應形成超氧亞硝酸根離子(,),能硝基化酪胺酸蛋白質(zhì)殘基產(chǎn)生硝基酪胺酸(,),具細胞毒性,可致細胞死亡。目前,誘導糖尿病時、 和新陳代謝的改變及其對心肌 損傷影響尚未完全明了。本實驗測定不同時期 誘導糖尿病心肌 表達、水平、血漿 水平及其對 損傷的影響,以期對部分機制作進一步探索。 材料和方法 實驗動物與分組 健康雄性 - 大鼠(美國

4、公司)平均體質(zhì)量約 隨機分為組:周和周的 處理組(和);周和周的(和)組,及時間相對應的對照組(, 和 );周組只大鼠,周組只大鼠。糖尿病是通過尾靜脈注射含 (美國公司,)的檸檬酸緩沖液( , )誘導而成。對照組單獨注射等量檸檬酸緩沖液。 注射后 及 實驗前收集尿樣、血樣測試尿糖和血糖。血糖超過,尿糖陽性者,歸為糖尿病組。為避免酮癥酸中毒,糖尿病組處理后一周大鼠開始皮下注射胰島素。該劑量胰島素僅為預防酮癥酸中毒, 注射胰島素后糖尿病組血糖仍保持在 以上。 急性心肌局部缺血和再灌注的模型 ( ) 和 ( )混合腹腔注射麻醉。右頸靜脈插管補充體液,左頸動脈插管監(jiān)測血壓和心率。氣管插管與犬齒動物呼吸

5、機相連。體溫用電熱墊維持在 。待心率和血壓穩(wěn)定后,施左胸切開術。暴露左冠狀動脈左前降支( ,),用絲線(-)縫合形成活的閉環(huán)。用止血鉗子夾緊閉環(huán)造成左心室局部缺血,心肌缺血的標志是心包膜表面蒼白且血壓下降。松開止血鉗再灌注。再灌注時血壓略微上升。實驗均為缺血 再灌注 心肌梗死面積大小的確定 左心室( ,)大小,梗死面積大小( ,),缺血區(qū)域( ,)均如先前文獻描述方法測定。簡言之,在 再灌注后, 再次被封閉。用埃文斯藍顏料()注入 腔, 為非藍染色,藍染者為正常灌注區(qū)。摘除心臟,沖洗多余的藍顏料,將左心室橫切為 厚切片。切片在 ,-三苯基氯化四氮唑(, , - ,) 緩沖液染色,梗死區(qū)為非 染

6、色,磚紅色染色區(qū)為可逆活性組織。每層切片的上下兩面均拍攝照片,使用 圖像軟件分析照片不同區(qū)域面積大小。每層切片兩邊的區(qū)域平均計算。表示為總 的百分比, 表示為 的百分比。 純化及免疫印跡分析 心臟左心室組織缺血區(qū)與其它部分分離,使用含 , , (美國 公司)的 緩沖液冰上勻漿后以 , 離心 。上清液貯于 冰箱待測。總蛋白質(zhì)濃度測定使用 - 蛋白測定包,根據(jù)說明書測定。的純化依照等的方法進行,使用,- (美國 公司)先純化,后加樣于聚丙烯酰胺膠體中,用電泳動方法將蛋白樣品分離,并被轉移在硝化纖維薄膜上。薄膜用低脂牛奶封閉過夜。然后使用抗 抗體(美國 公司)標記。特定抗體被對 線敏感的化學發(fā)光物(

7、 ,美國 公司)標記,并曝光于 線片上。 分析硝基酪氨酸 用免疫組化方法()分析硝基酪氨酸。的生成通過對其標志性產(chǎn)物的測定來代表。實驗末心臟左心室組織缺血區(qū)與其它部分分離并植入液,用液氮冷凍至 ,橫切為 厚切片。使用抗大鼠抗體 ( )標記心肌內(nèi)。使用 圖像軟件分析系統(tǒng)分析水平。 含量檢測 用硝酸還原酶法測定含量。我們用反應,通過對氧化反應的產(chǎn)物硝酸鹽()和亞硝酸鹽()水平總和的測定來反映血漿水平。實驗末從頸靜脈收集血液,冰上冷卻 ,然后以 , 離心 ,上清液貯于 冰箱待測。用硝酸還原酶將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,按操作規(guī)程測定其。制備亞硝酸鈉和硝酸鈉標準溶液,作出亞硝酸鈉和硝酸鈉濃度 值標準曲線。

8、并計算出和 總量。 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)標準差表示,用 統(tǒng)計軟件 影響因素分析。檢驗水準 。 結 果 血糖水平 在周和周糖尿病組中,血糖水平分別是 ( ) 和 ( ),相對應對照組 和 血糖水平分別是( ) 和 ( )。糖尿病組血糖顯著升高(糖尿病組血糖 相應時間對照組; , )。 平均動脈壓改變 表總結了糖尿病組和對照組平均動脈血壓()在缺血前、缺血期和再灌注期間的數(shù)值。在 鼠中,在缺血前、缺血期、再灌注期 均較對照組降低。在 中,在缺血前、缺血期和再灌注期 數(shù)值與對照組無顯著性差異。在 和 組的再灌注期, 均較缺血前期降低。 梗死面積大小和缺血區(qū)面積大小 缺血和再灌注后,在 組,梗死

9、面積比對照組 減少(分別為 , ),在 組中,梗死面積比對照組 組增加 (分別為 , ),糖尿病組與相應時間對照組有顯著性差異, 。缺血危險區(qū)域面積()大小在 , , 無組間差異。 心肌表達 免疫印跡分析顯示在 組中與 大鼠相比提高大約 (圖)。此外,表達在 組中與 大鼠相比減少大約。 含量檢測 用硝酸還原酶法測定 含量。在 組中 水平在基線和缺血再灌注后與對照組比較分別升高和。然而,在 組血中 水平在基線和缺血再灌注后與對照組比較分別降低和(圖)。 硝基酪氨酸測定 免疫組織化學染色顯示缺血前在 組較 組低(圖),在缺血再灌注后, 水平無顯著差異。在 組,缺血前及缺血再灌注后 水平分別較 大鼠

10、升高和。 討 論 本實驗結果顯示糖尿病周時,大鼠心臟在 后梗死面積比對照組減少,糖尿病周時,梗死面積比對照組增加。這表明糖尿病早期對心臟 損傷確有保護作用。 然而,至糖尿病周時這種保護作用不但消失,而且加重 的損傷。 多數(shù)學者認為,缺血再灌注損傷是氧自由基介導的脂質(zhì)過氧化、鈣超載、無復流等因素的病理生理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮損傷和功能異常是引起缺血再灌注損傷的又一重要原因,內(nèi)皮源性舒張因子即釋放減少是導致缺血再灌注損傷的重要因素。是小分子氣體, 可在許多細胞與組織合成。合成的前體為精氨酸, 在催化下合成。心肌細胞本身含有,可自身合成。具有擴張冠脈、改善心臟血液供應、縮小心肌梗塞范圍等作

11、用。 研究顯示在糖尿病心臟中的表達呈現(xiàn)矛盾的改變,包括增加,減少,無改變。本研究結果在心臟的表達與對照組相比在糖尿病周時短暫升高,但是在周時卻顯著減少。這提示在糖尿病時的變化是一個隨病程改變的過程,即早期代償性合成增加而晚期則合成減少。相應的, 本研究中 組中血漿 水平在缺血前和再灌注期與對照組比較分別升高和。然而,在 組血漿 水平在缺血前和再灌注期與對照組比較分別降低和這提示在糖尿病時的變化也是一個隨病程改變的過程,即早期代償性合成增加而晚期則減少。由于 是血管舒張因子,早期水平的升高可解釋為什么糖尿病大鼠周時血壓比對照組低。糖尿病早期高濃度 除舒張血管和增加血流外,也是內(nèi)皮細胞生存和心臟的

12、保護因子,可抑制細胞凋亡。本研究顯示,無論糖尿病組或對照組,缺血后含量明顯增加,可能系血流阻滯后蓄積所致。 有學者發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的血管內(nèi)皮細胞合成的能力下降。也有學者認為糖尿病動物或糖尿病患者的血管內(nèi)皮合成并不減少,在某一階段甚至反而增加,而糖尿病時生成的某些物質(zhì)對的滅活,則是依賴的血管舒張障礙的主要原因。缺血再灌注時,在冠狀動脈血流復通的開始幾分鐘,(快速形成,并與反應形成,是導致再灌注損傷的主要物質(zhì)。,高活性氧化劑,能硝基化酪胺酸蛋白質(zhì)殘基產(chǎn)生硝基酪胺酸。硝基酪胺酸具細胞毒性,可致細胞死亡。本研究中的形成藉由硝基酪胺酸水平的測定來評估。 糖尿病時體內(nèi)氧自由基生成增多,氧自由基極易與反應,如

13、超氧陰離子()即可與生成過硝酶根離子(),從而使失活。研究表明糖尿病動物的血管內(nèi)皮確實生成更多的,從而使失活增加。有報告認為自由基清除酶(, )如在糖尿病早期增加從而減少超氧化物的含量, 從而使失活減少,形成數(shù)量下降,有利于心肌細胞的存活。但在糖尿病慢性期時超氧化物(如)的含量升高,與 反應形成,從而使失活增加,導致血管舒張障礙, 抗缺血再灌注能力下降,水平顯著升高,促使心肌細胞死亡。這與本研究結果相符合,即含量在糖尿病早期比對照組低, 而在晚期比對照組高。 綜上所述, 誘導糖尿病早期、晚期對心肌 損傷呈現(xiàn)相反的作用。這可能是由于早、晚期糖尿病相反的心肌 表達,相應引起早晚期矛盾的及改變而引起的。 在心肌的表達在糖尿病早期增加, 然而在慢性期減少;心肌保護因子 血漿水平在糖尿病早期升高,但是在慢性期顯著降低;具細胞毒性物質(zhì)生成的標志性產(chǎn)物硝基酪氨酸在糖尿病早期生成減少,但在慢性期顯著增加。這說明在糖尿病的不同階段、對心肌 損傷占主導地位的機制可能都有不同。 【參考文獻】 馬國川,夏 焱,羅向陽,等糖尿病大鼠生存信號改變對對缺血再灌注損傷及心肌細

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