異源雙鏈和單鏈構(gòu)像多態(tài)法篩查基因突變

1、論著本課題受廣東省自然科學(xué)基金(編號(hào):960149和衛(wèi)生部回國(guó)人員啟動(dòng)基金資助作者單位:510060廣州,中山醫(yī)科大學(xué)中山眼科中心暨衛(wèi)生部眼科學(xué)實(shí)驗(yàn)室(張清炯、肖學(xué)珊、黎仕強(qiáng)、申煌煊、張豐生、吳開力,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室(曾瑞萍異源雙鏈和單鏈構(gòu)像多態(tài)法篩查基因突變張清炯肖學(xué)珊黎仕強(qiáng)申煌煊張豐生曾瑞萍吳開力【摘要】目的比較異源雙鏈、單鏈構(gòu)像多態(tài)(SSCP 、異源雙鏈2SSCP 法篩查突變的效率,尋找簡(jiǎn)便有效的基因突變篩查方法。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR 擴(kuò)增23個(gè)已知的雜合子突變,分別以異源雙鏈、SSCP 、異源雙鏈2SSCP 法分析突變,對(duì)比各方法對(duì)突變的檢出情況。結(jié)果23個(gè)雜合子突變中,異源雙

2、鏈法、SSCP 法與異源雙鏈2SSCP 法檢出突變分別為22個(gè)(96%、20個(gè)(87%和23個(gè)(100%。異源雙鏈法結(jié)果比SSCP 法結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性好,兩種方法之間有一定互補(bǔ)性,異源雙鏈2SS 2CP 法兼有兩種方法的特點(diǎn)。結(jié)論異源雙鏈2SSCP 法突變檢出率高,經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便,值得在基因突變篩查中推廣應(yīng)用?！娟P(guān)鍵詞】DNA 突變分析多態(tài)現(xiàn)象,單鏈構(gòu)象核酸異源雙鏈分子Comp arison of heteroduplex ,SSCP,and heteroduplex 2SSCP analyses in mutational screening ZhangQingjiong ,Xiao Xuesh

3、an ,Li Shiqiang ,et al 3Zhongshan Ophthalmic Center ,Sun Yat 2sen Univer sity o f Medical Sciences ,Guangzhou 510060【Abstract 】Objective T o com pare the effectiveness of heteroduplex ,SSCP and heteroduplex 2SSCP analy 2ses in mutational screening.Methods DNA sam ples with 23known heterozyg ous muta

4、tions were am plified by PCR.The PCR products were then analyzed by heteroduplex ,SSCP and heteroduplex 2SSCP analyses separately to testify the effectiveness of each method.R esults O f the 23mutations ,22were detected by heteroduplex analysis (96%,20by SSCP analysis (87%and 23by heteroduplex 2SSCP

5、 analysis (100%.Results from heteroduplex analysis are m ore stable and repeatable than those of SSCP and they may com plement each other.Heteroduplex 2SS 2CP analysis has the advantages of heteroduplex and SSCP analyses.Conclusion Heteroduplex 2SSCP analysis is sim ple ,economical and m ore effecti

6、ve than SSCP or heteroduplex analysis alone and it may be widely applied in mutational screening.【K ey w ords 】DNA mutational analysis S ingle 2stranded con formational polym orphism Nucleic acid heteroduplexes基因突變檢測(cè)是遺傳病病因分析與基因診斷的重要環(huán)節(jié)。基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR 產(chǎn)物分析的微小未知基因突變篩查方法,包括SSCP 、異源雙鏈、變性與溫度梯度凝膠電泳、RNA 酶裂解、化

7、學(xué)錯(cuò)配裂解、直接測(cè)序等,適用于涉及少數(shù)堿基的基因突變檢測(cè)1,2。這些方法中,SSCP 法3使用最廣泛,而異源雙鏈法4,5最簡(jiǎn)便,并已證實(shí)在直接檢出未知微小突變方面的效率。SSCP 法須用多條件分析,且結(jié)果不穩(wěn)定、重復(fù)性差,對(duì)大于200bp 片段中點(diǎn)突變檢出的效率差,因而許多PCR 產(chǎn)物須酶解后分析1,2,比較繁瑣又費(fèi)時(shí)費(fèi)錢。異源雙鏈分析結(jié)果穩(wěn)定,可分析較大片段(350bp 中的點(diǎn)突變1,2,6,7。我們?cè)鴮?duì)異源雙鏈法與SSCP 法篩查突變的情況作了初步比較分析7,并創(chuàng)立異源雙鏈2SSCP 法篩查基因突變8。我們分別應(yīng)用異源雙鏈、SSCP 、異源雙鏈2SSCP 三種方法檢測(cè)分布于20個(gè)DNA 片

8、段中的23個(gè)突變,并進(jìn)行了比較。材料和方法一、基因組DNA 制備抽取20例已知基因突變的遺傳病(先天性紅、綠色覺(jué)異常和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者外周靜脈血,以全血溶解法制備外周血白細(xì)胞基因組DNA 。二、標(biāo)準(zhǔn)突變及PCR 擴(kuò)增分布于20個(gè)DNA 片段中的23個(gè)突變見附表,其中5個(gè)突變分別分布于2種DNA 片段中,另有1個(gè)突變樣品有3處堿基變異(融合基因片段。每個(gè)882Chin J M ed Lab Sci ,September 1998,V ol 21,N o.5樣品中均有正常與突變拷貝各1個(gè),為雜合性突變。附表被檢標(biāo)本堿基突變性質(zhì)與位置及突變檢出情況編號(hào)PCR產(chǎn)物(bp突變性質(zhì)突變位置(nt+突變檢

9、出3異源雙鏈SSCP異源雙鏈2SSCP1206G del40+2227A del90+3116A del23+4250T del97+-+5184T del114+62435bp del103107+71435bp del5155+8294GC90+9185T ins.85+ 10212CT73+ 11182TC121-+ 12277GT153+ 13197GT99+ 14221CT99+-+ 15221G T del179180+ 16221GT102+ 17221CT64+-+ 18350CT164+ 19221C del104+ 20264CT96+ 21167CT34+ 22260AC

10、115+ 23260CT154+CG158TA192檢出陽(yáng)性份數(shù)222023檢出百分比(%9687100注:所有PCR產(chǎn)物中的突變均為雜合子;+突變位置從PCR產(chǎn)物正鏈5端計(jì);3指突變可以(+或不能(-被該方法檢出,突變性質(zhì)通過(guò)克隆測(cè)序得來(lái),檢測(cè)中均以正常DNA作為對(duì)照使用20對(duì)引物分別對(duì)含有23個(gè)雜合性突變的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度見附表。PCR產(chǎn)物均經(jīng)過(guò)2%3%NuSieve(FMC,US A瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn),然后直接進(jìn)行突變檢測(cè)分析(不必經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切。三、突變檢測(cè)1.SSCP分析:PCR產(chǎn)物稀釋24倍后與等容積2×加樣緩沖液(97%甲酰胺,20mm ol

11、/L E DT A, 0.05%溴酚藍(lán)及二甲苯氰混合,于96變性5分鐘后置于冰上冷卻,然后取25l混合物在6%聚丙烯酰胺凝膠于15或控制在室溫下30W電泳9小時(shí)。用銀染色法檢測(cè)觀察DNA帶紋。21異源雙鏈分析:PCR產(chǎn)物與等容積2×加樣緩沖液(97%甲酰胺,20mm ol/L E DT A,0.05%溴酚藍(lán)及二甲苯氰混合,然后取14l混合物在8%聚丙烯酰胺凝膠于室溫下或1530W電泳89小時(shí)。用銀染色法檢測(cè)觀察DNA帶紋。3.用異源雙鏈2SSCP法篩查基因突變:(1PCR 產(chǎn)物與等容積2×加樣緩沖液混合,于96變性5分鐘后置于冰上冷卻5分鐘,然后立即取14l在8%的聚丙烯酰

12、胺凝膠于室溫下30W電泳89小時(shí)。用銀染色法檢測(cè)觀察DNA帶紋。在此條件下異源雙鏈帶紋比SSCP帶紋好。(2根據(jù)PCR擴(kuò)增的效率,PCR產(chǎn)物略為稀釋(或不稀釋后與等容積2×加樣緩沖液(97%甲酰胺,20mm ol/L E DT A,0. 05%溴酚藍(lán)及二甲苯氰混合,于96變性5分鐘后置于冰上冷卻5分鐘,然后立即取25l在6%的聚丙烯酰胺凝膠(40cm×30cm×1mm,1×T BE,含10%甘油于15下30W電泳89小時(shí)。用銀染色法檢測(cè)觀察DNA帶紋。在此條件下SSCP帶紋比異源雙鏈帶紋好。結(jié)果23個(gè)雜合性突變分布于116350bp的20個(gè)DNA片段中,

13、異源雙鏈法可檢出22個(gè)突變(96%, SSCP可檢出20個(gè)突變(87%,而異源雙鏈2SSCP聯(lián)合法可檢出全部23個(gè)突變(附表。從附表可以看出,突變的檢出與否同堿基組成成分、突變位置無(wú)明確關(guān)系。3個(gè)未被SSCP法檢出、1個(gè)未被異源雙鏈法檢出的突變中,1個(gè)為缺失突變、3個(gè)為單堿基置換。有趣的是,N o.17和N o. 18為同一外顯子中同一突變,N o.17的DNA片段較短,反而其中的突變未能被SSCP法檢出。3個(gè)未被SSCP法檢出的突變,其所在DNA片段長(zhǎng)度均>200 bp;而20個(gè)可被SSCP法檢出的突變中,13個(gè)突變所在的DNA片段長(zhǎng)度>200bp。僅1個(gè)分布于184bp 片段中

14、的單堿基置換未能被異源雙鏈法檢出。3例不能被SSCP法檢出的突變均可被異源雙鏈法檢出,而1例不能被異源雙鏈法檢出的突變則可被SSCP 法檢出。異源雙鏈法2SSCP法具有兩種方法的特點(diǎn),可檢出所有23個(gè)突變。在結(jié)果觀察中我們發(fā)現(xiàn),大部分突變雖然可同時(shí)被SSCP法和異源雙鏈法檢出,但有的SSCP帶紋變異明顯、有的異源雙鏈帶紋變異明顯(附圖,單用一種方法分析有時(shí)難以確定是否有突變,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性與假陰性。在我們分析的23個(gè)突變中沒(méi)有一個(gè)突變出現(xiàn)兩種帶紋都不清晰或不明顯的情況,982中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志1998年9月第21卷第5期上部為SSCP分析結(jié)果,下部為異源雙鏈分析結(jié)果,上、下對(duì)應(yīng)樣品相同。第5道為

15、一單堿基置換(表1編號(hào)10,其SS2CP帶紋變異明顯,而異源雙鏈帶紋變異則不明顯(在銀染色過(guò)程中清晰可見兩條緊鄰帶紋。第9、10道分別為單堿基置換和2bp缺失(表1編號(hào)14、15,其異源雙鏈帶紋變異明顯,而SSCP帶紋變異則不明顯。第11道為單堿基置換(表1編號(hào)16,僅見異源雙鏈帶紋異常圖1異源雙鏈法與SSCP法檢測(cè)突變的比較總有一種帶紋異常比較明顯。由于異源雙鏈2SSCP 法可同時(shí)有兩種方法的結(jié)果,相互補(bǔ)充與印證,故具有明顯的優(yōu)越性。如在用聯(lián)合法分析紅與綠色覺(jué)基因外顯子5的260bp RCR產(chǎn)物中,紅色覺(jué)基因片段(r與綠色覺(jué)基因片段(g,p之間在中部分別有10(r/g和11(r/p個(gè)堿基差異

16、;綠色覺(jué)基因片段g 與p之間有一個(gè)堿基差別。通過(guò)異源雙鏈2SSCP聯(lián)合法分析可以明確確定來(lái)源于紅與綠色覺(jué)基因的不同片段。討論SSCP法是基于單鏈構(gòu)像多態(tài)來(lái)分離不同DNA 片斷3,而異源雙鏈?zhǔn)腔陔p鏈構(gòu)像多態(tài)來(lái)分離不同DNA片斷46。聯(lián)合應(yīng)用兩種方法,在同一凝膠中基于不同機(jī)制來(lái)檢測(cè)同一突變,理應(yīng)有一定互補(bǔ)性和優(yōu)越性,因此我們?cè)诠ぷ髦忻鹘⒘水愒措p鏈2SSCP法8。該法集合了異源雙鏈和SSCP兩種方法的優(yōu)點(diǎn),通過(guò)控制待檢樣品變性與復(fù)性過(guò)程、待檢樣品與變性劑的比例、電泳條件等,在同一電泳膠中既可觀察到異源雙鏈帶紋、又可觀察到SSCP 帶紋,突變檢出率高于單用SSCP或單用異源雙鏈,同時(shí)也提高了突變

17、檢出結(jié)果的可靠性,而操作與SSCP分析類似(未增加試劑、設(shè)備和難度,值得在突變篩查、DNA多態(tài)分析和臨床基因診斷中推廣應(yīng)用。異源雙鏈2SSCP法的突變檢測(cè)原理:雜合性DNA樣品在變性解鏈成單鏈后,既可復(fù)性形成4種雙鏈(包括正常同源雙鏈、突變同源雙鏈、突變正鏈與正常負(fù)鏈之異源雙鏈、突變負(fù)鏈與正常正鏈之異源雙鏈、又可不復(fù)性而形成4類多種立體構(gòu)像單鏈(突變正鏈、突變負(fù)鏈、正常正鏈、正常負(fù)鏈四類。一個(gè)雜合性DNA樣品經(jīng)異源雙鏈2SSCP聯(lián)合法分析后,不同單、雙鏈DNA在凝膠電泳過(guò)程中由于其立體構(gòu)像、凝膠分辨率等多種因素的影響,在雙鏈帶紋區(qū)可出現(xiàn)14條帶,在單鏈帶紋區(qū)可出現(xiàn)少至1條、多至4條以上的帶紋。

18、如果PCR產(chǎn)物未經(jīng)極度稀釋,在急劇降溫條件下可同時(shí)形成SSCP和異源雙鏈。用異源雙鏈SSCP聯(lián)合法對(duì)純合突變進(jìn)行分析時(shí),應(yīng)加入等量正常PCR產(chǎn)物混合后變性,然后進(jìn)行電泳分析。參考文獻(xiàn)1G rom pe M.The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids.Nature G enetics,1993,5:111.2D ownton S B,S laugh RA.Diagnosis of human heritable diseases2labora2 tory approaches and outcome.Clin Chem,19

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