脾內(nèi)移植GM-CSF基因修飾小鼠胎肝細(xì)胞對(duì)化療造血損傷的促恢復(fù)作用

1、    脾內(nèi)移植GM-CSF基因修飾小鼠胎肝細(xì)胞 對(duì)化療造血損傷的促恢復(fù)作用        動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)脾臟移植的肝細(xì)胞50能夠選擇性移入肝臟，并在其中較長(zhǎng)期存活和有效表達(dá)外源基因。我們通過(guò)脾內(nèi)途徑移植腺病毒載體GM-CSF基因修飾的胎肝細(xì)胞，觀察其對(duì)化療造血損傷的恢復(fù)影響。 材料和方法1動(dòng)物與主要試劑BALB/c小鼠，46周齡，C57BL/6孕鼠，孕齡1618天，購(gòu)自上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；熒光標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體IgG1購(gòu)自Gibco；表達(dá)小

2、鼠lac Z、小鼠粒-單核細(xì)胞集落刺激因子(mGM-CSF)基因的重組腺病毒Ad LacZ,Ad GM-CSF由日本癌癥研究會(huì)分子生物治療研究室Hamada博士惠贈(zèng)。2小鼠胎肝細(xì)胞懸液的制備及體外基因修飾剪碎胎肝于200目鎳網(wǎng)過(guò)濾，Tris-NH4Cl溶解其中紅細(xì)胞，按MOI(Mutiple of infection)50分別加入攜帶mGM-CSF cDNA、對(duì)照l(shuí)ac Z cDNA的重組腺病毒，轉(zhuǎn)染2小時(shí)后洗2遍，溶于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染效率經(jīng)X-gal染色證實(shí)大于85%。3胎肝細(xì)胞脾臟內(nèi)注射24小時(shí)前腹腔注射氟尿嘧啶(150mg/kg)的化療小鼠在全麻狀態(tài)下分別脾臟內(nèi)注射0.2ml

3、 DMEM、胎肝細(xì)胞及基因修飾的胎肝細(xì)胞（LacZ-FLC，GM-CSF-FLC），覆蓋止血明膠并縫合腹膜。4外周血白細(xì)胞數(shù)檢測(cè)及血涂片分類(lèi)計(jì)數(shù)取小鼠尾靜脈血，按常規(guī)方法進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)及涂片分類(lèi)計(jì)數(shù)。5粒-巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)的檢測(cè)于20馬血清、20雙倍DMEM、20DMEM、2U/mlmGM-CSF和0.3瓊脂的培養(yǎng)體系中放入1×105個(gè)脾臟有核細(xì)胞或0.5×105個(gè)骨髓有核細(xì)胞，置37, 5CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)67天，計(jì)數(shù)由850個(gè)細(xì)胞組成的CFU-GM集落數(shù)。6CD34細(xì)胞的檢測(cè)通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以結(jié)合熒光抗體細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的百分率表示。7統(tǒng)

4、計(jì)學(xué)處理采用未配對(duì)計(jì)數(shù)資料的t檢驗(yàn)。結(jié) 果1化療小鼠外周血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞數(shù)量的變化如1所示，與其它各組相比，GM-CSF基因治療組白細(xì)胞抑制期明顯縮短，且下降幅度?。≒<0.05），白細(xì)胞數(shù)量提前56天開(kāi)始回升；同時(shí)，GM-CSF基因治療組于化療后69天中性粒細(xì)胞比例達(dá)到最高(0.30)，而胎肝或Lac Z治療組中性粒細(xì)胞比值與對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明GM-CSF基因療法對(duì)白細(xì)胞，特別是中性粒細(xì)胞有顯著促恢復(fù)作用。    1移植GM-CSF-FLC對(duì)化療小鼠白細(xì)胞的影響2化療小鼠脾臟和骨髓CFU-GM水平的變化GM-C

5、SF基因治療組于化療后7和14天脾臟CFU-GM形成水平明顯高于正常組及各治療組（7天時(shí)，P<0.05; 14天時(shí)，P<0.01）；胎肝或Lac Z基因治療組的脾臟CFU-GM水平亦高于對(duì)照組（P<0.05），但升高水平均低于GM-CSF基因治療組(見(jiàn)2)；而GM-CSF基因治療組7天和14天的骨髓CFU-GM形成水平與各治療組相比，未見(jiàn)顯著差異。    2移植GM-CSF-FLC對(duì)化療小鼠脾臟CFU-GM的影響3化療小鼠CD34+細(xì)胞含量的變化化療后第14天GM-CSF基因治療組小鼠脾臟CD34細(xì)胞比例明顯高于各治療組（P<0.

6、05）, 而骨髓中CD34細(xì)胞雖有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(附表)。附表脾內(nèi)移植GM-CSF-FLC對(duì)化療小鼠脾臟和骨髓CD34+細(xì)胞含量的影響組別CD34細(xì)胞(%)脾臟骨髓正常組2.7±0.444.3±0.74化療組1.1±0.114.5±0.66化療+DMEM組1.4±0.203.9±0.50化療+FLC組1.2±0.134.0±0.47化療+LacZ-FLC組1.5±0.134.3±0.39化療+GM-CSF-FLC組2.9±0.414.7±0.72  

7、   討 論本研究表明，脾內(nèi)移植GM-CSF基因修飾的小鼠胎肝細(xì)胞不僅能促進(jìn)外周血白細(xì)胞數(shù)目提前恢復(fù)，尚能提高中性粒細(xì)胞比例，特別是在白細(xì)胞降至最低點(diǎn)時(shí)中性粒細(xì)胞比例最高，達(dá)29%，有助于宿主度過(guò)致命的感染期。Aglietts等1研究發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)直接注射GM-CSF因子，停用72小時(shí)后升高的白細(xì)胞數(shù)目可反跳性降低，甚至低于正常水平；而GM-CSF基因療法通過(guò)在體內(nèi)恒定的GM-CSF分泌，避免了大劑量GM-CSF直接注射后的負(fù)反饋現(xiàn)象。探討GM-CSF基因療法促進(jìn)造血恢復(fù)的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)脾內(nèi)移植GM-CSF基因修飾的FLC不僅能顯著促進(jìn)小鼠脾臟CFU-GM、CD34+細(xì)胞數(shù)目的

8、恢復(fù)及提高，有效刺激機(jī)體以粒單系為主的造血前體細(xì)胞分化、成熟，尚能通過(guò)GM-CSF的體內(nèi)表達(dá)與T淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合，刺激機(jī)體內(nèi)源性GM-CSF、G-CSF及M-CSF等造血因子產(chǎn)生，進(jìn)一步增強(qiáng)了GM-CSF基因療法的造血刺激作用。但實(shí)驗(yàn)中我們亦觀察到GM-CSF基因療法不能減輕化療對(duì)骨髓早期造血功能毒性的影響，這與Schwartz等2應(yīng)用GM-CSF細(xì)胞因子療法的發(fā)現(xiàn)相一致，可能與GM-CSF促進(jìn)化療后骨髓前列腺素(PGE2或PGF2)的合成，從而下調(diào)骨髓造血有關(guān)，而聯(lián)合應(yīng)用PG合成抑制劑可逆轉(zhuǎn)前列腺素對(duì)骨髓的造血抑制作用。本課題受軍隊(duì)九五重點(diǎn)基金（96Z

9、032）資助作者單位: 200433上海， 第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室（弭靜、曹雪濤、王全興、于益芝、張明徽）; 山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（袁孟彪）參 考 文 獻(xiàn)1Aglietts M, Monzeglio C, Pasquino P, et al. Short-term administration of granulocyte-macrophage colony stimulating factor decreases hematopoietic toxicity of cytostatic drugs. Cancer, 1993,72:2970-2973.2Schwartz GN, Hakim F, Zuiewski J, et al. Early suppressive effects of ch