蛋白免疫印跡雜交(WesternBlot)技術(shù)手冊

1、蛋白免疫印跡雜交（Western Blot）技術(shù)手冊A 蛋白樣本提取制備 蛋白樣品制備是 Western Blotting 的第一步，更是決定 WB 成敗的關(guān)鍵步驟， 總體原則和注意事項： 1：盡可能提取完全或降低樣本復雜度只集中于提取目的蛋白 （通過采用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產(chǎn)品） 2：保持蛋白的處于溶解狀態(tài) （通過裂解液的 PH 鹽濃度 表面活性劑、 還原劑等 的選擇） 3：提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等， （低溫操作，加入合適的蛋 白酶和磷酸酶抑制劑） 4：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策 略）5:樣品分裝，長期于-80°C中

2、保存，避免反復凍融。A-1 細胞或組織裂解 A-1-1 細胞裂解裂解液 Lysis buffer 或商品化蛋白抽提試劑盒的選擇 * 目的蛋白分布定位 推薦裂解液 Lysis buffe 推薦試劑盒 全細胞 NP-40 or RIPA （附錄1） 全蛋白抽提試劑盒 細胞質(zhì)（可溶蛋白） Tris-HCI （附錄1） 胞漿蛋白和核蛋白抽提試劑盒 線粒體蛋白提取試劑盒 細胞質(zhì)（細胞骨架等不溶蛋白） Tris-Triton （附錄 1） 蛋白分級抽提試劑盒 細胞質(zhì)（磷酸化蛋白）磷酸化蛋白抽提試劑盒細胞膜 NP-40 or RIPA （附錄1） 膜蛋白抽提試劑盒 蛋白分級抽提試劑盒細胞核 RIPA （附錄

3、1） 核蛋白抽提試劑盒 線粒體 RIPA （附錄1） 線粒體蛋白抽提試劑盒 亞細胞定位蛋白抽提試劑盒細胞裂解操作方法:1 培養(yǎng)的細胞經(jīng)預冷的 PBS 漂洗 2 次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑 （種類與量見本節(jié) 2）2 吸凈PBS,加入預冷的裂解液，（1 ml per 107cells/100mm dish/150cm2flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2flask）.3 用細胞刮子刮取貼壁細胞，將細胞及裂解液溫和地轉(zhuǎn)移至預冷的微量離心管中，4 4°C搖動 30 min5 4C離心12,000 rpm, 20 min （根椐細胞

4、種類不同調(diào)整離心力）6 輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移至新預冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄 沉淀.A-1-2 組織裂解1 用滅菌的預冷的工具分離目的組織，盡量置于冰上以防蛋白酶水解，2將組織塊放在圓底的微量離心管或 Eppendof管中，加入液氮凍結(jié)組織于 冰上均質(zhì)研磨，長期可保存于-80°C，3每約5 mg加入約300卩l(xiāng)預冷的裂解液lysis buffer，冰浴勻漿后置于4C搖 動 2 小時，裂解液體積與組織樣本量有適當比例， （最終的蛋白濃度至少達到 0.1 mg/ml, 理想的蛋白濃度 應為 1-5 mg/ml）.4 4C離心12,000 rpm, 20 min,輕輕吸取上清

5、，轉(zhuǎn)移至新預冷的微量離心管 中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀,A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制劑推薦購商品化蛋白酶和磷酸酶抑制劑復合試劑盒或 COOKTAILA-3 蛋白定量Bradford 法 Lowry 法或 BCA 法 (均有商品化試劑盒可選擇， 操作簡單、 需分 光光度計或酶標儀) ，小牛血清白蛋白 (BSA) 作為標準曲線。如果裂解液中有 NP40 或其它表面活性劑，則推薦使用 BCA 法。A-4 電泳上樣樣品的準備A-4-1 變性、還原蛋白樣本 一般的抗體只能識別抗原蛋白中的部份序列結(jié)構(gòu)(表位) ，因此，為使抗 體能夠達到結(jié)合該表位而需要將蛋白樣本進行變性，使之打開折疊的空間結(jié)構(gòu)， 蛋白

6、變性一般使用含陽離子變性去污劑如SDS的上樣buffer (loading buffer),并于 95-100°C 煮沸 5 分鐘，對于多次跨膜蛋白，可以于 70°C 加熱 5-10 分 鐘，標準的上樣 buffer 稱為 2X Laemmli buffer， 上樣時與樣本！：！混合后變性上樣即可：2X Laemmli buffer4% SDS10% 2-mercaptoehtanol20% glycerol0.004% bromophenol blue0.125 M Tris HClCheck the pH and bring it to pH 6.8.SDS 的陰離子環(huán)

7、繞蛋白肽鍵使之帶負電荷，蛋白分子量不同，結(jié)合的 SDS 數(shù) 量不同，所帶負電荷也不同，電泳遷移速度不同，因此 SDS-PAGE 電泳可將不 同分子量的蛋白分離開。A-4-2 天然和非還原樣本 某些抗體識別的表位是非連續(xù)氨基酸構(gòu)成的蛋白三維結(jié)構(gòu)， 此種情況則需要進 行非變性的 WB，抗體的說明書一般會標注，這種非變性電泳不加SDS，樣本 也不需煮沸。某些抗體僅識別蛋白的非還原態(tài)，如某些 cysteine 基的氧化態(tài)，因此 loading buffer 和電泳液中不加入?-mercaptoethanol and DTTB 電泳B-1 PAGE 膠的制備聚丙酰胺凝膠PAGE電泳根椐蛋白分子量進行分離

8、蛋白，PAGE膠是由兩種化合 物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）.，聚合需加入過 硫酸銨及 DMAP 或 TEMED ，凝膠為中性、水溶性、三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠的孔 徑取決于總丙烯酰胺的百分含量（T）和交聯(lián)度（C） ，T%=（a+b）/m*100%;和 C%=a/（a+b）*100%,其中：a= 雙體（bis）的重量；b=單體（arc）的重量；m=溶液的 體積（ml）。丙烯酰胺總量增加，則孔徑減小，5%C構(gòu)成最小的孔徑，任何的%C 增加或降低，孔徑都增加，凝膠的百分濃度組成需兩個參數(shù)，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）.的總量百分濃度（w/v）

9、 oB-2 蛋白分子量 Marker 預染或非預染各種分子量的蛋白，用于標示電泳中蛋白的大小和示蹤B- 3 陽性對照目的蛋白或明確表達目的蛋白的組織或細胞的蛋白提取物， 用于檢驗整個實驗 體系和過程的正確性有效性/特別是一抗的質(zhì)量和效率。建議使用該對照。可查 閱文獻或抗體說明書選擇購買或自提該對照樣本。B-4 內(nèi)參對照 管家基因編碼的、很多組織和細胞中都穩(wěn)定表達的蛋白，用于檢測整個 WB 實 驗過程及體系是否正常工作，并作為半定量檢測目的蛋白表達量的標準對照。 必 須設(shè)立。B- 3陽性對照目的蛋白或明確表達目的蛋白的組織或細胞的蛋白提取 物，用于檢驗整個實驗體系和過程的正確性有效性， 特別是一

10、抗的質(zhì)量和效率。建議使用該對照?？刹殚單墨I或抗體說明書選擇購買或自提該對照樣本。B-5 上樣與電泳每孔上樣量為20-40卩g蛋白，使用專用槍頭或注射針頭，勿溢出加樣孔，標準電泳緩沖液： 1X Tris-glycine：25 mM Tris base190 mM glycine0.1% SDS調(diào) pH;8.3.電泳時間按電流儀說明書推薦方法使用 ,（1 小時或過夜， 取決于電壓大?。?，當染 料到達膠的底部，關(guān)電源 停止電泳，膠不能存放，應立刻進行下一步的轉(zhuǎn)膜。C 轉(zhuǎn)膜與顯色（ Western Blot）C-1 膠中蛋白的檢測 電泳后檢測蛋白是否遷移正確與平均，可采用銅染或考馬斯藍染色檢測，如

11、果凝膠中的蛋白需要進行轉(zhuǎn) 膜則需可逆的銅染法，否則采用不可逆考馬斯藍法染色。銅染法：電泳膠用蒸餾水洗數(shù)秒鐘，加入0.3 M CuCI2染色5-10分鐘，再用去離子水洗一次，在暗背景下觀察在蘭色膠背景下蛋白出現(xiàn)透明條帶， 膠置于 0.10.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0緩沖液中漂洗脫色兩次， 再置于電轉(zhuǎn)緩沖液中開 始轉(zhuǎn)膜。考馬斯藍法：用 40%雙蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定膠中蛋白，考馬斯 藍 R-250 染液（凱基產(chǎn)品）室溫染色 4 小時至過夜，保持搖勻，轉(zhuǎn)入 67.5%雙蒸 水,7.5%醋酸,25%甲醇I搖勻至脫去多余的染料，蛋白被染成深藍色。C-2

12、 蛋白轉(zhuǎn)膜蛋白因結(jié)合SDS而帶電荷，在電場下從膠中轉(zhuǎn)至膜上，轉(zhuǎn)膜操作根椐電轉(zhuǎn)儀制 造商的說明書進行轉(zhuǎn)膜方式分為半干和濕轉(zhuǎn)兩種， 半干式轉(zhuǎn)膜速度快， 而濕式成 功率高并特別適合用于分子量大于 100KD 的蛋白。濕式轉(zhuǎn)膜三明治排列為：海綿 /紙/膠 /膜 /紙/海綿，全部緊密排列，特別是膠 /膜之 間不能留有氣泡， 三明治安放的方向確認正確負極方為帶負電的膠里的蛋白， 向 正極方（膜）電遷移。標準的電轉(zhuǎn)緩沖液為 1X Tris-glycine buffer不含SDS，但加入20%甲醇，如果 轉(zhuǎn)膜的蛋白分子量大于80KD，則推薦加入SDS使之終濃度為0。1%。半干式轉(zhuǎn)膜中，三明治的排列為： /紙/

13、膠/膜/紙，用電轉(zhuǎn)緩沖液浸濕后，直接置 于電轉(zhuǎn)儀的正負極之間。膠于負極而膜置于正極。 半干式的電轉(zhuǎn)緩沖液可不同 于濕式的電轉(zhuǎn)緩沖液， 推薦為： 48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲 醇， 兩類膜可供選擇：硝酸纖維素膜和 PVDF 膜（正電荷尼龍膜），根據(jù)不同 需要選擇（下表） ， PVDF 膜需要浸泡甲醇中 1-2 分鐘，再孵育于冰冷的電轉(zhuǎn)緩 沖液中 5 分鐘，膠也需在冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡 3-5 分鐘，否則轉(zhuǎn)膜時會導 致條帶變形。注：大蛋白和小蛋白的轉(zhuǎn)膜電轉(zhuǎn)移緩沖液中 SDS 與甲醇的平衡、蛋白的大小、膠的濃度都會影響轉(zhuǎn)膜效果， 如下調(diào)整可以

14、增加轉(zhuǎn)膜效率：大蛋白（大于 100 KD）1對于大蛋白而言，其在凝膠電泳分離遷移較慢，而從凝膠轉(zhuǎn)出也非常慢， 因此對于這種大分子量蛋白。應該用低濃度的凝膠， 8 %或更低，但因低濃度的膠非常易碎，所以操作時需十 分小心。2 大蛋白易在凝膠里形成聚集沉淀，因此；轉(zhuǎn)膜時在電轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度為0.1%的SDS，以避免出現(xiàn)這種情況，甲醇易便 SDS從蛋白上脫失，因此 應降低電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的濃度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。3 降低電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的比例以促進凝膠的膨脹，易于大蛋白的轉(zhuǎn)出。4 如果使用硝酸纖維素膜，甲醇是必需的，但如果是 PVDF 膜，甲醇可以不 必加入電轉(zhuǎn)移緩沖液中，但轉(zhuǎn)膜

15、前 PVDF 需用甲醇活化。5選擇濕式，4 C轉(zhuǎn)膜過夜，以取代半干式轉(zhuǎn)膜。小蛋白（小于 100 KD1 SDS 妨礙蛋白與膜的結(jié)合，特別是對小蛋白更是如此，因此，對于小分子 的蛋白，電轉(zhuǎn)移緩沖液中可以不加 SDS。2 保持 20%的甲醇濃度。更多的轉(zhuǎn)膜注意事項：? 避免用直接接觸膜，應使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會封閉轉(zhuǎn)膜效率并易 產(chǎn)生背景污斑? 排列三明治時，盡量用移液器或 15ml 試管趕除膠與膜之間的氣泡，或?qū)⑷?明治放在裝有的培養(yǎng)皿中以防止氣泡產(chǎn)生，請戴手套！? 確認裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同，否剛導致電流不能通過膜，從而轉(zhuǎn)膜 無效? 雞抗體易于與 PVDF 膜和其它尼龍膜結(jié)合， 導

16、致高背景， 請?zhí)鎿Q成硝酸纖維 素膜以降低背景。C-3 膜上蛋白的檢測：麗春紅 為檢測轉(zhuǎn)膜是否成功，可用麗春紅染色， 2%的麗春紅貯備液 （20ML） ： 2%麗春紅（0.4克）溶于 30%三氯乙酸 （6克）和 30%磺基水楊酸 （6 克） 麗春紅染色工作液： 2%的麗春紅貯備液 1：10 稀釋，即加 9 倍的 ddH2O染色方法：,在室溫下?lián)u動染色 5 分將膜放入 TBST 洗一次，再置于麗春紅染色工作液中鐘， 大量的水洗膜直至水變清無色蛋白條帶清晰，膜也可以用 TBST 或水TBST 洗后進行封閉重新洗后再進行染色） PVDF 膜需用甲醇再活化后用10x TBS 的配制 ：24.23 g T

17、rizma HCl80.06 g NaCl 加約 800 ml 超純水 用純 HCl 調(diào) pH 至 7.6 定容至 1 L.TBST 的配制 ：配制 1 L TBST：: 量取 100 ml 10x TBS + 900 超純水 + 1ml Tween20Tween20 非常粘稠， 用槍頭不易吸取， 請確定加入準確的量， 最好用 Tris buffer. 配成10%的Tween20母液后使用。C-4 膜的封閉為防止一抗或 /和二抗與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的高背景，因此需要進行膜的封 閉，傳統(tǒng)上有兩種圭寸閉液：脫脂奶粉或 BSA,脫脂奶粉成本低但不能用于磷酸 化蛋白(因脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身

18、就是一種磷酸化蛋白) ，使用脫 脂奶粉會結(jié)合磷酸化抗體從而易產(chǎn)生高背景。 某些抗體用 BSA 圭閉時因不明 原因可能會產(chǎn)生比脫脂奶粉更強的信號, 請仔細閱讀說明書注明的注意事項和膜 的特殊的圭閉方法。配制5%脫脂奶粉或BSA溶液：每100 ml TBST中加入5 g脫脂奶粉或BSA， 混勻后過濾,如不過濾會導致使膜污染上細微黑顆粒。 圭閉時, 4°C 搖動,圭 閉 1 hour ，再用 TBST 洗5秒，進入下一步抗體的孵育。C-5 一抗的孵育孵育Buffer:按抗體說明書建議的稀釋倍數(shù)，用TBST稀釋一抗，如果說明書沒 有建議的稀釋倍數(shù)， 則參照一般推薦的稀釋倍數(shù) (1:100-1

19、:3000)，一抗?jié)舛冗^高會 導致產(chǎn)生非特異性條帶。某些實驗室傳統(tǒng)上在圭閉液中孵育抗體， 而有些實驗室用不含圭閉劑的 TBST 來 孵育抗體，結(jié)果因抗體而異，有時兩者結(jié)果相同，有時結(jié)果不同。注：如果不存在高背景的問題，某些抗體用含低濃度(0.5 - 0.25%)脫脂奶粉或BSA 的圭閉液來 ,稀釋，可產(chǎn)生相對更強的信號條帶。孵育時間： 一抗的孵育時間可從幾小時至過夜 (一般不超過 18 小時)不等，取 決于抗體與蛋白的親和性和蛋白的含量豐度， 建議使用較高的抗體稀釋倍數(shù)和較長的孵育時間來保證特異性孵育溫度： 盡可能低溫孵育， 如果在封閉液中孵育一抗過夜， 應在 4°C 進行否 則會產(chǎn)

20、生污染而破壞蛋白 (降別是磷酸基團)。 孵育一抗時需保持適當?shù)膿u動使 之均勻覆沒膜，防止結(jié)合不均勻。C-6 二抗的孵育一抗孵育結(jié)束后，用 TBST 搖動洗膜數(shù)次，每次 5min 或更長，去除殘 留的一抗。 孵育 Buffer 和稀釋倍數(shù)：用 TBST 按說明書推薦的倍數(shù)稀釋二抗， 如果說明書沒有標出稀釋倍數(shù)，則按常規(guī)的倍數(shù)稀釋(1:1000- 1:20,000)預試，二抗的濃度過高也會導致非特異性條帶。 亦可以在封閉液中孵育二抗 (和一抗) ， 但可能在降低背景同時導致特異性條帶的信號也減弱， 可能是封閉劑阻礙了抗體 與靶蛋白的結(jié)合。孵育時間和溫度：室溫、 1-2 hours, 搖動二抗連接物

21、：推薦使用二抗連接HRP,不建議連接AP堿性磷酸酶，因其不夠靈敏。C-7 顯色 顯色分為酶促底物發(fā)光和化學發(fā)光法或熒光法 酶促底物發(fā)光法代表為 DAB 顯色法附錄 1 WB 實驗試劑配方1 Nonidet-P40 (NP40) buffer150 mM sodium chloride1.0% NP-40 (或 Triton X-100 )50 mM Tris, pH 8.02 RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer)150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 or Triton X-1000.5% sod

22、ium deoxycholate0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate)50 mM Tris, pH 8.0注：The 10% sodium deoxycholate stock solution (5 g into 50 ml) must be protected from light.3 Tris-HCl buffer20 mM Tris-HCl, pH 7.54 Tris-Triton buffer10 mM Tris, pH 7.4100 mM NaCl1 mM EDTA1 mM EGTA1% Triton X-10010% glycerol0.1% SDS

23、0.5% deoxycholateAll four of these buffers will keep at 4°C for several weeks or for up to a year aliquotted and stored at -20°C.5 TBS 10x (concentrated TBS)24.23 g Trizma HCl80.06 g NaClMix in 800 ml ultra pure water.pH to 7.6 with pure HCl.Top up to 1 L.TBSTFor 1 L: 100 ml of TBS 10x + 900 ml ultra pure water + 1ml Tween206 PBS: 1.16 g Na2HPO4,