PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)操作步驟

1、PCR 擴(kuò)增反響、實(shí)驗(yàn)原理PCR 是一種選擇性擴(kuò)增 DNA 或 RNA 勺方法， 其根本原理是依據(jù) 體 內(nèi)細(xì)胞分裂中的 DNA 半保存復(fù)制機(jī)理，以及在體外 dNTP 分子于不 同溫 度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變勺性質(zhì)， 人為地控制體外合成系統(tǒng) 的溫度， 以促使雙鏈 DNA 變成單鏈 DNA 單鏈 DNA 與人工合成的引物 退火，以及 在 dNTP 存在下，耐高溫的 DNA 聚合酶使引物沿單鏈模板 延伸成為雙鏈 DNA。PCF反響分3步：變性：通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂， 雙 鏈解離形成單鏈DNA退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)，由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜得多，而且反響體系中引物DNA 量大大多于模

2、板DNA 使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA 雙鏈之間互補(bǔ)的時(shí)機(jī)較少。延伸：在 DNA聚合酶和4種dNTP底物及Mg+存 在的條件下， 5' -3'的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的 DNA 鏈延伸反 應(yīng)，以 上 3 步為一個(gè)循環(huán)， 每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模 板，數(shù)小 時(shí)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性 DNA 片段得到了大量復(fù) 制，數(shù)量可 達(dá) 2X io"? 拷貝。圖反響歷程1 ?模板：細(xì)菌DNA 2 ? TsgDNA聚合酶3 ? dNTP昆合液4 ? 10 倍濃度 PCR 緩沖液 5? 2.5mmol/LMgCI2 6? RAPE 引物:S14

3、 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7?提取細(xì)菌DNA的相關(guān)試劑三、操作步驟1. 細(xì)菌染色體DNA的提取見(jiàn)上一組2. RAP 反響體系的配置試劑濃度參加吐加10 倍濃度 PCFg2.5ul沖液樣順序氯化鎂溶液2.5mmol/L2.5ul>dNTP?昆合液各 2,5mmol/L2.5ul上游引物2.5umol/L2.5ul下游引物2.5umol/L2.5ul細(xì)菌DNA25-50ng 2.SulTsgDN展合酶2.5U超純水10ul總體積25ul3 ?反響程序:將RAP 反響試劑參加EP管中輕混后用100ul石蠟油覆蓋于反響混合液之上，防止樣品在反

4、復(fù)加熱-冷卻的過(guò)程中蒸發(fā)，蓋好蓋子翻開(kāi)PCF反響儀輸入以下反響數(shù)據(jù)94攝氏度預(yù)變性5min 94攝氏度變性40s40攝氏度退火40s 72攝氏度延伸1mi n將EP管放入儀器開(kāi)始擴(kuò)增，循環(huán) 35次；72攝氏度延伸10min儀 器為 Model MyGene 25 Plus三、本卷須知1、PCF 反響體系中 DNA 樣品及各種試劑的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性及全部放入反響體系中。2、為防止污染但凡用在 PCF 反響中的 Tip 尖、離心管、蒸餾水都 要 滅菌；吸每種試劑時(shí)都要換新的滅菌 Tip 尖。3、加試劑時(shí)先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶V4、置 PCF 儀進(jìn)行 PCF 反響前， PCF 管要蓋緊，否那么使液體蒸發(fā)影 響 PCF 反響。5. 引物條件 首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)， 其次引物與引物 之 間防止形成穩(wěn)定二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)， 再次引物不能在模