細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟

1、培養(yǎng)基的配置：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml+胎牛血清50ml+雙抗5ml 凍存液的配置：DMS018m胎牛血清2ml。依次比例酌量配置。超凈工作臺(tái)常規(guī)配置移液器1套（2.5卩l(xiāng)、20卩l(xiāng)、200卩l(xiāng)、1ml）,酒精燈1盞，液器1臺(tái)，斜架1臺(tái)，酒精噴壺 1 個(gè)，酒精棉球缸 1 個(gè)，污缸 1 個(gè)，常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,槍頭（1ml、200卩l(xiāng)、10卩l(xiāng) ）,培養(yǎng)皿，6/24/48/96孔板，醫(yī)用脫脂棉球，保種管所需試劑：gibco高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗，DMS0胰酶，苯扎溴氨，75% 酒精實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：所需的各項(xiàng)高壓后的耗材放于超凈工作臺(tái)內(nèi)， 用酒精噴壺噴灑

2、實(shí)驗(yàn)臺(tái)面， 并關(guān)閉 工作臺(tái)打開(kāi)紫外燈照射 30min 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。首次傳代前細(xì)胞的復(fù)蘇，首先用一大燒杯盛滿37C的溫水放于液氮罐旁邊，待細(xì)胞株取出后留上端1/3于37r水面上盡最大速搖動(dòng)管使其在2min內(nèi)迅速融化。 若種管頂部含有凍存的細(xì)胞液在搖動(dòng)期間用力甩動(dòng)使其降于管底后再搖動(dòng)。 這一 過(guò)程可在超凈工作臺(tái)外操作。實(shí)驗(yàn)步驟一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)1. 紫外消毒 30min 后關(guān)閉紫外燈，開(kāi)啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作 者的雙手。2. 將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基瓶 口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開(kāi)瓶蓋后再 次分別消毒瓶口

3、和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜 架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈最近的位置，瓶蓋置于酒精燈的 另一側(cè)。3. 取 1 個(gè)高壓后的新培養(yǎng)瓶，瓶口在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開(kāi)后分別再次消 毒瓶口和瓶蓋 2-3 次分別放于酒精燈兩側(cè)，把保種管在超凈臺(tái)外用酒精棉球 擦拭下 2/3 后拿進(jìn)超凈臺(tái)內(nèi)在酒精燈上消毒保種管口 2-3 次放于臺(tái)面左手邊， 取 1ml 移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒 1-2 次，然后再裝上槍頭吸取保種管 內(nèi)的細(xì)胞液，懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。4. 拿出 1 支高壓后的 5ml 定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動(dòng)移液器 上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液

4、管管身 2-3 次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶 內(nèi)吸取 4ml 培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消 毒 2-3 次后擰緊平放，在瓶身做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。5. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒 2-3 次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出 實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。6. 將培養(yǎng)瓶放于28C,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開(kāi)瓶口少許。注意整個(gè)培養(yǎng)箱 底托盤(pán)內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無(wú)菌。在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-12h，瓶蓋擰緊后拿出培養(yǎng)箱，置于熒光倒置顯微鏡 下觀察細(xì)胞貼壁情況，及細(xì)胞形態(tài)。最后更換培養(yǎng)液。二、培養(yǎng)液的更換1紫外消毒 30min 后關(guān)閉紫外燈，開(kāi)啟超凈臺(tái)正常工作狀

5、態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開(kāi)瓶蓋后再 次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜 架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈最近的位置，瓶蓋置于酒精燈的 另一側(cè)3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開(kāi)后分別再次消毒瓶口和瓶蓋 2-3 次，瓶蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消 毒 2-3 次瓶口，4拿出 1支高壓后的 5ml 定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動(dòng)移液器 上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管

6、管身 2-3 次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶 內(nèi)吸取 4ml 培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消 毒 2-3 次后擰緊平放。5將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒 2-3 次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出 實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。6.將培養(yǎng)瓶放于28C,5%CO2勺培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開(kāi)瓶口少許。每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般 72-96h 后，細(xì)胞生長(zhǎng)密度大于 90%，即可進(jìn) 行細(xì)胞勺傳代。、細(xì)胞傳代1. 紫外消毒 30min 后關(guān)閉紫外燈，開(kāi)啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者勺雙手。2. 將所需勺培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培 養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒

7、精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒 2-3 次， 旋開(kāi)瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈勺兩側(cè)。特別是將培 養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈最近勺位置，瓶蓋 置于酒精燈勺另一側(cè)。3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開(kāi)后分別再次消毒瓶口和瓶蓋 2-3 次，瓶蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)勺培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒 2-3 次瓶口，豎直放好。取 1ml 移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒 1-2 次， 然后再裝上槍頭吸取 1.5ml 胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。4. 將培養(yǎng)瓶平放使胰酶浸沒(méi)整個(gè)瓶壁的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)約40s，立馬豎起對(duì)著燈 光可觀察到細(xì)胞與細(xì)

8、胞之間有針孔樣縫隙，并有 1-2 個(gè)細(xì)胞脫落，這時(shí)為胰 酶消化的最適時(shí)機(jī)。若看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過(guò)度；若看不 到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落，則需繼續(xù)消化，輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸 沒(méi)細(xì)胞層 1s 后迅速豎起對(duì)著燈光觀察細(xì)胞情況， 可反復(fù)幾次， 直至出現(xiàn)針孔 樣縫隙和 1-2 個(gè)細(xì)胞脫落的最佳消化狀態(tài)。用移液器將胰酶吸凈。5. 吸取 1ml 培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗 培養(yǎng)瓶壁 5-8 次，使貼壁細(xì)胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打 2-3 次，使細(xì) 胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。6. 取 2 或 3個(gè)高壓后的新培養(yǎng)瓶，瓶口在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開(kāi)后分

9、別再 次消毒瓶口和瓶蓋 2-3 次分別放于酒精燈兩側(cè)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)基均勻的分 到 3 或 4 個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（注意原來(lái)傳代時(shí)使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用） ，進(jìn)行 1傳 3或 1傳 4的培養(yǎng)。7. 拿出 1支高壓后的 5ml 定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動(dòng)移液器 上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身 2-3 次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶 內(nèi)吸取 4ml 培養(yǎng)基懸空移入每個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上 消毒 2-3 次后擰緊平放，在瓶身做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。8. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒 2-3 次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出 實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。9. 將培養(yǎng)瓶放于2

10、8C,5%CO2勺培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開(kāi)瓶口少許。注意整個(gè)培養(yǎng)箱 底托盤(pán)內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無(wú)菌。每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般 72-96h 后，細(xì)胞生長(zhǎng)密度大于 90%，即可進(jìn) 行細(xì)胞勺傳代或保株。四、細(xì)胞株勺保存1. 紫外消毒 30min 后關(guān)閉紫外燈，開(kāi)啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者勺雙手。2. 將所需勺培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培 養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒 2-3 次， 旋開(kāi)瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈勺兩側(cè)。特別是將培 養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈最近勺位置，瓶

11、蓋 置于酒精燈勺另一側(cè)。3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開(kāi)后分別再次消毒瓶口和瓶蓋 2-3 次，蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)勺培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3 次瓶口，豎直放好。取 1ml 移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒 1-2 次，然 后再裝上槍頭吸取 1.5ml 胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。4. 將培養(yǎng)使胰酶浸沒(méi)整個(gè)瓶壁的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)約40s，立馬豎起對(duì)著燈光可觀 察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙，并有 1-2 個(gè)細(xì)胞脫落，這時(shí)為胰酶消化 的最適時(shí)機(jī)。若看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過(guò)度；若看不到針孔 樣縫隙和細(xì)胞脫落，則需繼續(xù)消化，輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒(méi)細(xì)胞層

12、 1s 后迅速豎起對(duì)著燈光觀察細(xì)胞情況， 可反復(fù)幾次， 直至出現(xiàn)針孔樣縫隙 和 1-2 個(gè)細(xì)胞脫落的最佳消化狀態(tài)。用移液器將胰酶吸凈。5. 吸取 1ml 細(xì)胞凍存液于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù) 沖洗培養(yǎng)瓶壁 5-8 次，使貼壁細(xì)胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打 2-3 次， 使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。6. 將 1ml 含有細(xì)胞的凍存液移入新的保種管內(nèi)，擰緊瓶蓋，做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。7. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒 2-3 次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出 實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。8. 將保種管先放于4C冰箱30min后拿出放置-20 C冰箱過(guò)夜，次日再放于-80

13、C 的冰箱內(nèi)3-4天，最后存放于-196 C的液氮灌內(nèi)長(zhǎng)期保存。注此過(guò)程也可簡(jiǎn)化因?qū)嶋H操作過(guò)程中經(jīng)驗(yàn)所得：步驟 7 結(jié)束后將保種管用干 脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80 C冰箱內(nèi)4-5天，即可放于液氮灌保存。 但-80 C冰箱也可保存細(xì)胞株2-3月。五、細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作前：紫外消毒 30min 后關(guān)閉紫外燈， 開(kāi)啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)， 用酒精消毒 操作者勺雙手。1. 預(yù)混液 AfugeneHD5ul/孔+0PTI-MEM45ul孔室溫溫育 lOmin2. 預(yù)混液 Barr16ul/ 孔+0PTI-MEM34ul孔室溫溫育 5min3. 預(yù)混液C空載16ul/孔+0PTI-MEM34ul孔室溫溫育5min4. 預(yù)混液 Darr12ul/ 孔 +ops12ul/ 孔+0PTI-MEM26ul孔室溫溫育 5min注：fugeneHD為轉(zhuǎn)染試劑，arr，空載，ops為模板？ 0PTI-MEM空培養(yǎng)基5.將步驟 2,3,4 中的預(yù)混液 B,C,D 中分別加入步驟 1 中的等體積的預(yù)混液 A， 輕柔混勻，室溫溫育15mi n，再次輕柔混勻后室溫溫育15mi n。6.取出 6 孔培養(yǎng)板，將每培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基全部吸凈，無(wú)殘留，是為了防止殘留的雙抗和胎牛血清影響轉(zhuǎn)染效果。加入 1