霉菌試驗工作流程修訂原件2霉菌試驗技術手冊

1、霉菌試驗工作流程二零零零年四月二十五日二零零二年十一月 待修改目 錄一、試驗前的準備1、 滅菌方法（附錄A）2、 選擇菌種3、 制備培養(yǎng)基4、 倒平板5、 菌種的移植、培養(yǎng)及保藏6、 無機鹽溶液、浸漬（營養(yǎng)）液的制備方法7、 試驗設備準備8、 試驗場所及用具的滅菌9、 試驗所需用具10、 對照樣品的準備11、 試驗樣品的準備12、 安裝試驗樣品及對照樣品13、 預處理二、制備混合孢子懸浮液三、試驗四、樣品出箱及最終檢測五、出具試驗報告及資料歸檔六、附錄A滅菌方法（包含整個霉菌試驗過程中的滅菌方法）一、 試驗準備1、 選擇菌種1.1 菌種來源 菌種來源必須是經(jīng)國家認可的菌種保藏和研究機構提供的純

2、正菌種。1.2 試驗菌種按照試驗標準有關條款規(guī)定的菌種名稱和菌號準備菌種（各行業(yè)標準要求試驗菌種名稱和菌號見表1、各種菌種受影響的材料見表2）。1.3 菌種檢查 在菌種移植前，對試驗用菌種進行純度檢查，如有不純或變異的菌種應及時更換。菌種留試驗備用及菌種貯存。2、 制備培養(yǎng)基 霉菌試驗中常用的培養(yǎng)基有：查氏培養(yǎng)基（Ca）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。菌種保存時查氏培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）應交替使用,防止菌種退化。2.1 查氏培養(yǎng)基2.1.1 主要成份硝酸鈉（NANO3） 3.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4） 1.0g氯化鉀（KCL） 0.5g硫酸鎂（MgSO47H2O） 0

3、.5g硫酸亞鐵（FeSO47H2O） 0.01g蔗糖 30g瓊脂 （1520）g蒸餾水 1000mlPH 6.8表1 各行業(yè)標準要求試驗菌種名稱和菌號標準代號菌種名稱菌種編號備注GJB150.10-86HB5830.13-86黑曲霉 Aspergillus niger3.3928 黃曲霉 Aspergillus flavus3.3950 雜色曲霉 Asprygillus versicolor3.3885繩狀青 Penicillum funiculosum3.3875,3.3872 球毛殼霉 Chaetomium globosum3.4254 GJB.150.10A-200X(未實施)黑曲霉 A

4、spergillus nigerAS 3.3928 兩組選擇一組，或根據(jù)需要附加菌種。土曲霉 Aspergillus terreusAS 3.3935 宛氏擬青霉 Paecilomyces variotiAS 3.4253 繩狀青霉 Penicillum funiculosumAS3.3875AS3.3872 赭綠青霉 PenicillumochrochloronAS3.4302 短柄帚霉 Scopulariopsis brevicaulisAS 3.3985 綠色木霉 Trichoderma virideAS 3.3942 黃曲霉 Aspergillus flavus3.3950雜色曲霉 A

5、sprygillus versicolor3.3885繩狀青霉 Penicillum funiculosum3.3875,3.3872 球毛殼霉 Chaetomium globosum3.4254 黑曲霉 Aspergillus nigerAS 3.3928 GB/T2423.16-99黑曲霉 Aspergillus nigerAS 3.3928 土曲霉 Aspergillus terreusAS 3.3935 出芽短梗霉 Aureobasidium pullulansAS 3.3984 宛氏擬青霉 Paecilomyces variotiAS 3.4253 繩狀青霉 Penicillum f

6、uniculosumAS3.3875AS3.3872赭色青霉 Penicillium ochrochloronAS 3.4302光孢短柄帚霉 Scopulariopsis brevicaulisAS3.3985 綠色木霉 Trichoderma virideAS 3.3942 GJB4.10-83黑曲霉 Aspergillus niger3.3928 薩氏曲霉 Asperaillus sydowi3.3943宛氏擬青霉 Paecilomyces varioti3.4253 球毛殼霉 Chaetomium globosum3.4254 臘葉芽枝霉 Cladosporium herbarum3.3

7、897康寧木霉 Trichoderma koningii3.4004 產黃青霉 Penicillium chrysogenum3.3890 土曲霉 Aspergillus terreus3.3935 頂青霉 Penicillium chrylophilum3.3889 注：菌種編號為中國科學院北京微生物研究所保藏的菌種編號表2 各菌種受影響的材料序號菌種名稱、編號及受影響的材料1黑曲霉 Aspergillus niger 3.3928 在許多材料上廣泛生長，對銅鹽有抵抗性2黃曲霉 Aspergillus flavus 3.3950 皮革 3雜色曲霉 Asprygillus versicolor

8、 3.3885 皮革 4繩狀青霉 Penicillum funiculosum3.3875,3.3872 織物、塑料、棉織品 5球毛殼霉 Chaetomium globosum 3.4254 纖維素 6土曲霉 Aspergillus terreus AS 3.3935 帆布、紙板、紙 7宛氏擬青霉 Paecilomyces varioti AS 3.4253 塑料、皮革 8繩狀青霉 Penicillum funiculosum AS 3.3875,3.3872 織物、塑料、棉織品 9綠色木霉 Trichoderma viride AS 3.3942 塑料、織物 10出芽短梗霉 Aureobas

9、idium pullulans AS 3.3984 侵蝕涂料與皮革 11赭色青霉 Penicillium ochrochloron AS 3.4302 對銅鹽有抵抗性，侵蝕塑料與紡織品 12光孢短柄帚霉 Scopulariopsis brevicaulis AS 3.3985 侵蝕橡膠 13薩氏曲霉 Asperaillus sydowi 3.3943 纖維素 14康寧木霉 Trichoderma koningii 3.4004 15產黃青霉 Penicillium chrysogenum 3.3890 16頂青霉 Penicillium chrylophilum 3.3889 2.1.2 制備

10、方法a) 材料和器皿 DT100單盤天平，電爐子或電磁爐，石棉網(wǎng)，燒杯，1000ml的容器，漏斗，試管，玻璃棒等。 其它F20APH計，牛角匙，潔凈紗布、棉花等。b) 方法和步驟 預先在容器內倒入半量的蒸餾水（500ml）； 用DT-100單盤天平稱出各種成份（詳見電子天平稱的使用說明書）； 配制時除磷酸氫二鉀以外，其余成份和蔗糖依次溶入蒸餾水中； 每加一種成份后應用玻璃棒充分攪拌，待完全溶解后再加第二種； 磷酸氫二鉀另溶于200ml的蒸餾水中，然后加入上述的溶液中，最后加蒸餾水至規(guī)定體積，并加入瓊脂；6 將裝有各種成份的燒杯放在石棉網(wǎng)上，用文火加熱并用玻璃棒徐徐攪拌，使各種試劑完全溶解，放入

11、蔗糖，溶化后加蒸餾水至1000ml；7 初配好的查氏培養(yǎng)基是偏酸性的，故要氫氧化鈉（NaOH）調PH；為避免過堿，應緩慢加入氫氧化鈉（NaOH），邊加邊攪拌并不時地用F20APH計測試或用PH試紙測得PH值為6.8；8 過濾培養(yǎng)基可用2層紗布趁熱過濾（適宜溫度應為50左右）。9 分裝試管將查氏培養(yǎng)基趁熱加至漏斗上。分裝時左手并排地拿數(shù)根試管，右手控制彈簧夾開關，將培養(yǎng)基依次加入各試管。用于制作斜面培養(yǎng)基時，裝量不超過試管（15mm×150mm）高度的1/5（約3ml4ml）。分裝時謹防培養(yǎng)基沾在試管口上，以免使棉塞沾上培養(yǎng)基而造成染菌。 滅菌將上述冷卻后的查氏培養(yǎng)基斜面試管放入高壓蒸

12、氣濕熱滅菌鍋內進行滅菌（滅菌方法詳見附錄A中培養(yǎng)基或接種液滅菌法）。2.2 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）2.2.1 主要成份馬鈴薯 200g葡萄糖 20g瓊脂 （1520）g蒸餾水 1000mlPH 5.82.2.2 制備方法a) 材料和器皿 DT100單盤天平，電爐子或電磁爐，石棉網(wǎng)，燒杯，1000ml的容器，漏斗，試管，玻璃棒等。 其它F20APH計，牛角匙，潔凈紗布、棉花等。b) 方法和步驟 將馬鈴薯用水洗干凈，去皮挖去芽眼，切成小塊，稱取200g。然后再稱取葡萄糖20g; 用DT-100單盤天平稱出各種成份備用（詳見電子天平稱的使用說明書）; 加熱溶解將備好的200g馬鈴薯放入潔凈并裝

13、有1000ml的蒸餾水中，加熱煮沸1小時后用紗布過濾，在添加蒸餾水使之達到1000ml，注入20g瓊脂再加熱，待瓊脂完全溶化后，加入20g葡萄糖； 調節(jié)PH初配好的馬鈴薯培養(yǎng)液是偏酸性的，故要氫氧化鈉（NaOH）調PH。為避免過堿，應緩慢加入氫氧化鈉（NaOH），邊加邊攪拌并不時地用F20APH計測試或用PH試紙測得PH值為5.8； 過濾培養(yǎng)基可用2層紗布趁熱過濾（適宜溫度應為50左右）； 分裝試管將馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基趁熱加至漏斗上。分裝時左手并排地拿數(shù)根試管, 右手控制彈簧夾開關，將培養(yǎng)基依次加入各試管。用于制作斜面培養(yǎng)基時，裝量不超過試管（15mm×150mm）高度的1/5（約3

14、ml4ml）。分裝時謹防培養(yǎng)基沾在試管口上，以免使棉塞沾上培養(yǎng)基而造成染菌； 滅菌將上述冷卻后的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基斜面試管放入高壓蒸氣濕熱滅菌鍋內進行滅菌（滅菌方法詳見附錄A中培養(yǎng)基或接種液滅菌法）。2.3 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（生化試劑）2.3.1 主要成份馬鈴薯葡萄糖瓊脂2.3.2 制備方法a) 材料和器皿 DT100單盤天平，電爐子或電磁爐，石棉網(wǎng)，燒杯，1000ml的容器，漏斗，試管，玻璃棒等。 其它牛角匙，潔凈紗布、棉花等。b) 方法和步驟 稱取馬鈴薯葡萄糖瓊脂62克，加入1升蒸餾水中，加熱溶解，后在12120min高壓滅菌備用。 分裝試管斜面試管分裝方法同2.2.2中及滅菌。 倒平板

15、方法和步驟同3中3.1.3、 倒平板(用于霉菌孢子活力檢驗以及菌種分離)3.1 方法和步驟 融化培養(yǎng)基取裝在三角瓶內的培養(yǎng)基置于水浴中煮沸、融化后取出，待冷卻至溫度50左右（以不燙手為宜），供倒平板用。 將若干無菌培養(yǎng)皿疊放在左側，便于拿?。?點燃酒精燈，將火焰調到適中（空氣不要太大，以免氣流過急）； 倒平板時，先用左手握住三角瓶的底部，傾斜三角瓶，用右手旋松棉塞，然后用右手的小指和手掌邊緣夾住棉塞并將它撥出（切勿將棉塞放在桌面上），隨之將瓶口的周緣在火焰上過一下（不可灼燒，以防爆烈），以殺死可能沾在瓶口處的雜菌。然后將三角瓶從左手傳至右手中（用右手的拇指、食指和中指拿住三角瓶的底部），在這操

16、作過程中瓶口應保持在離火焰2-3cm處，瓶口始終向著火焰，左手拿起一套培養(yǎng)皿，用中指、無名指和小指托住培養(yǎng)皿底部，用食指和大拇指托住皿蓋并開啟一縫，恰好能讓三角瓶口伸入，迅速倒入培養(yǎng)基約12ml，加蓋后平置于桌面上，用手輕輕推搖培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布（手持不穩(wěn)，容易造成平面歪斜），平置于桌面上待凝。然后將三角瓶移至左手，瓶口再次過火并塞緊棉塞； 貼標簽 將完全凝固后并無冷凝水的培養(yǎng)皿在皿底貼上標簽，并注明檢測類型、組別及日期等（也可用記號筆書寫在皿底）； 培養(yǎng) 把裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿倒置放入25-30的恒溫箱內培養(yǎng)三天； 檢測培養(yǎng)皿 將培養(yǎng)三天后的無菌培養(yǎng)皿從恒溫箱內取出。若培養(yǎng)皿內培養(yǎng)基有雜

17、菌或被污染就淘汰掉，沒有雜菌或未被污染的培養(yǎng)皿備用。4、菌種的移植、培養(yǎng)4.1菌種的移植 貼標簽將注有菌名、接種日期和接種者姓名的標簽貼在試管培養(yǎng)基斜面的正上方（離試管口約3-4cm處）； 點燃酒精燈 點燃酒精燈，并將火焰調至適中； 旋松棉塞經(jīng)滅菌后的棉塞纖維常粘在試管壁上，為了接種時易于拔出，故應先旋松棉塞（切勿將棉塞拔出）； 手持試管將菌種管及待接種的斜面試管并排放置在左手的食指、中指的無名指之間,試管一般宜保持水平位置，兩個試管口要平齊，斜面朝上，用拇指按住試管的基部（注意勿使拇指遮住整個斜面）。 灼燒接種針（環(huán)）右手握在接種針（環(huán)）的膠木柄上（如握鉛筆狀）。將鎳鉻針（環(huán)口）和其余部分在

18、火焰的氧化焰部位燒紅，然后將接種針（環(huán)）的金屬柄也通過火焰兩三次，進行滅菌。 用右手無名指和小指掌邊先后夾住兩支試管的棉塞，在火焰旁輕輕地拔出，同時將試管口通過火焰兩三次，然后讓試管稍離火焰，仍應保持水平狀態(tài)，以防雜菌由管口進入污染菌種。 移植將燒紅的接種針（環(huán)）伸入菌種管中，先使針（環(huán)）端輕觸斜面的頂端或邊緣，令其冷卻后再挑取少許菌苔快速移至待接種試管斜面上，自基部開始劃至一條線（要求培養(yǎng)基不能劃破）。接種完后，移出接種針（環(huán)），同時將兩支試管口依次過火，最后塞上棉塞，并將試管插在試管架上。 殺滅接種針(環(huán))上的殘菌接種完后應立即灼燒接種針（環(huán)），以殺死殘留的菌體。如接種針（環(huán)）上的菌絲較粘

19、濕，則應先燒紅接種針（環(huán)）柄部分，再逐漸移至接種針（環(huán)）口處灼燒，否則殘留于針（環(huán)）上的菌體會因驟然灼燒而四處飛濺并造成污染。同時把灼燒后的接種針（環(huán)）放入裝有盛有酒精的錐形瓶中。 清洗 廢棄的菌種試管應放入高壓蒸氣滅菌鍋內進行滅菌（滅菌方法見附錄A）。滅過菌后的菌種試管應拔去棉塞放入浸泡在配制好的84消毒液中，48小時內刷洗干凈。 無菌培養(yǎng)室內的滅菌（滅菌方法見附錄A） 超凈工作臺滅菌（滅菌方法見附錄A）4.2 菌種培養(yǎng) 將新移植的菌種試管再次旋緊了防脫落。然后插在試管架上，放置在2530的恒溫箱內培養(yǎng)1421天。菌種培養(yǎng)期間應及時觀察菌苔在試管培養(yǎng)基上的生長情況，經(jīng)培養(yǎng)后可取生長良好的菌株

20、作為保藏菌種 結果記錄將新培養(yǎng)菌種過程、結果記錄于附表3中 試分析斜面接種成敗的原因 對培養(yǎng)1421天合格的菌種拍攝照片并記錄存檔。5、 菌種的保藏(見附錄B)6、 試驗設備準備試驗前，對所有的試驗設備進行檢查維護工作。 主要有：更換濕球紗布；給加濕水箱加滿蒸餾水；給濕球紗布補水槽加蒸餾水至標線位置；檢查冷機或風機皮帶松緊度，如有破損即更換；檢查試驗箱內加濕出水有無堵塞，及時清理；檢查箱內滅菌燈開關是否在“關”的正常位置；檢查箱室通氣開關是否處于“關”的正常位置；根據(jù)所依據(jù)試驗標準中規(guī)定的試驗條件和設備操作規(guī)程啟動試驗箱，設置試驗參數(shù)（含溫度、濕度上下限、風速、加濕水箱等），當檢查試驗設備處于

21、正常工作狀態(tài)時，即關機待用。7、試驗樣品的準備7.1 外觀檢查記錄試驗樣品的初始狀態(tài)。逐一進行嚴格的外觀檢查。如樣品表面的光潔度、缺陷及材料工藝等，并作詳細記錄。7.2 試驗樣品的清潔處理試驗樣品不般是不進行清潔處理的。如果試驗目的是考核試品材料的耐霉性、試品所用防霉劑的效果或委托方要求需對樣品進行清潔處理時（但在試驗報告中一定要注明此樣品已清理）。那么試品就需要進行清理，以排除試驗樣品表面的油污、汗?jié)n、灰塵等外來物的干擾，真實地反映出試驗樣品的耐霉性。 清潔試品時可用75%或95%的已醇或蒸餾水，輕輕擦抹、晾干（清潔要在試驗進行前72小時進行），以讓任何揮發(fā)物質蒸發(fā)。7.3 性能檢測如試驗樣

22、品需要進行性能檢測時，應作好記錄。7.4 安裝試驗樣品及對照樣品試驗樣品置放在樣品架上或懸掛到掛鉤上懸掛，應盡量減少其接觸部分，試驗樣品與試驗樣品之間距離應大于5cm，與箱壁間距離應大于10cm，樣品之間的距離應保持空氣自由流動。對照樣品垂直懸掛在箱門與試驗樣品同高，靠近試驗樣品處，不與樣品接觸。7.5 預處理試驗樣品和對照樣品安裝結束后，按試驗所依據(jù)的標準要求，試驗箱開機運行。樣品在所設定的試驗條件下，預處理4h后進行接種。8、對照樣品的準備8.1 制備對照樣品 對照樣品應選用白棉布或濾紙制成，尺寸約3×13cm(或共長度與試驗樣品同高)，每次試驗的樣品不得少于3件（應參照各標準所

23、要求的不同進行來處理對照樣品）。8.2 配制對照樣品的浸漬溶液或營養(yǎng)液(表3、表4) 9、試驗所需用具及滅菌（見附錄A） 100ml錐形量杯3個； 玻璃棒20根； 150ml錐形磨口瓶6個（瓶中含有45ml蒸餾水和5075粒直徑為5mm的玻璃球）； 直徑為5cm玻璃漏斗10個； 離心試管6包(每包6個)；蒸餾水1000ml; 50ml量筒2個； 20ml磨口帶蓋試管6支；移液管20支； 喉頭噴霧器2個； 15cm2過濾紗布6塊，15cm2清潔紗布10塊； 裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿6個； 250ml長頸；紗瓶2個； 玻璃刮產6個； 離心試管瓶塞6包（每包6個）； 廢液瓶1個。表3 浸漬（營養(yǎng)）液的制備

24、方法浸漬（營養(yǎng)）液制備方法項目GB/T2423.16GJB4.10-83GB/T2423.16GJB4.10-83成份磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.7g磷酸氫二鉀（K2HPO4）0.3g硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.5g硝酸鈉（NaNO3）2.0g氯化鉀（KCL）0.5g硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）0.01g蔗糖 30.0g蒸餾水加至100ml液體查氏培養(yǎng)基1、將浸漬溶液的的成份按量稱好，依次放入潔凈的盛有100ml蒸餾水的容器內。2、用氫氧化鈉或鹽酸調PH值至5.3把對照樣品浸入新配制的液體查氏培養(yǎng)基中，取出滴干，立即應用。表3（續(xù)） 浸漬（營養(yǎng)）液的制備方法浸

25、漬（營養(yǎng)）液制備方法項目GJB150.10-86HB5830.13-86GJB150.10-86HB5830.13-86成份甘油 10g磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.1g硝酸銨（NH4NH3）0.1g硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.025g酵母膏 0.005g蒸餾水 加至100ml1、將無機鹽溶液的各成份按量稱好，依次放入潔凈的盛有100ml蒸餾水的容器內。2、調PH值用氫氧化鈉或鹽酸調PH值至6.06.5之間，否則應重新配制。二、制備混合孢子懸浮液（以GJB150中規(guī)定的方法為例,其它各標準可按有關條款的規(guī)定執(zhí)行，沒有具體要求的可參照此方法）1、工作臺內向培養(yǎng)14-21天的菌種

26、試管中注入無菌水溶液10ml。2、用接種針（環(huán)）或玻璃棒將培養(yǎng)基上生長的菌種刮入溶液中。3、將試管中的孢子溶液倒入裝有45ml無菌水和50-70粒直徑5mm實心玻璃球的容積為150ml的帶蓋錐形瓶內，并向瓶中注入每升含0.05g濕潤劑（吐溫80或吐溫60）。4、充分搖動錐形瓶，粉碎孢子團，使孢子打散（也可把錐形瓶放在振蕩器上以每分鐘300轉的速度粉碎孢子團）。表4 無機鹽溶液、浸漬（營養(yǎng)）液的制備方法一、 無機鹽溶液的制備方法無機鹽溶液配制方法項目GJB150.10-86HB5830.13-86GJB150.10-86HB5830.13-86成份磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.7g磷酸氫二鉀（K

27、2HPO4）0.7g硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.7g硝酸銨（NH4NH3）1.0g氯化鈉（NaCl）0.005g硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）0.002g硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）0.002g硫酸錳（MnSO4·7H2O）0.001g蒸餾水 1000ml1、將無機鹽溶液的各成份按量稱好，依次放入潔凈的盛有1000ml蒸餾水的容器內。2、調PH值用氫氧化鈉或鹽酸調PH值至6.06.5之間，否則應重新配制。注：其它各標準在做混合孢子懸浮液時用無菌蒸餾水稀釋5、孢子懸浮液用裝有雙層紗布的玻璃漏斗過濾到6個離心試管中，再放入離心機中。6、用離心機（

28、轉動約3分鐘）分離孢子懸浮液，倒棄離心試管中的上層清液。7、將沉淀物用45ml無菌水再次懸浮，離心分離共進行三次。8、孢子記數(shù) 鏡檢計數(shù)室先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清潔后才能進行計數(shù)。血球計數(shù)板中間的大格為記數(shù)室，每個大格的面積為1mm2，載波片與蓋波片之間的高度為0.1mm，記數(shù)室體積為0.1mm3每個大格分為25個中格，每個中格又分為16個小格，測數(shù)時以四角四個中格和中間中格共五個中格內總孢子的平均數(shù)（每格內最好有3-5個孢子為宜，達到標準中要求每ml孢子懸浮液含：孢子數(shù)/毫升=5個中格內孢子總數(shù)÷5×25×104×稀釋倍數(shù)。共有1,

29、000, 000±20%個孢子數(shù)）。測數(shù)時壓格兩邊的孢子要計算在內，而壓另兩邊的孢子不計算在內。 加樣品 將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋波片，把裝有各菌種的孢子原溶液用無菌移液管吸取1ml，由蓋波片邊緣滴一小滴（不宜過多），讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自行進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產生。 顯微鏡計數(shù)靜止5分鐘后, 先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)?？雌錆舛仁欠穹弦?，如不符合其標準規(guī)定所要求的孢子數(shù)量則將進行稀釋（反復稀釋，直至滿足試驗所需的濃度要求）。 稀釋用無菌移液管吸取1ml的無機鹽溶液滴入各菌種的孢子原溶液中，后再重復、中的步驟。9、

30、孢子活力檢查在配制成混合孢子懸浮液之前，將鏡檢合格的每種單一的孢子懸浮液用無菌移液管吸取（不得重復使用）0.2-0.3ml成三點式或用玻璃刮產涂布均勻分別滴入土豆葡萄糖瓊脂平板上，。放在2530培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，檢查其生長情況，每一種試驗菌種都應生長正常，否則使用該混合孢子懸浮液進行的試驗無效。 注：使用新鮮制備的混合孢子懸浮液，若不能當天使用，則必須在25保葳，不得超過7天。 注意：如試驗所依據(jù)的標準中無規(guī)定檢查每毫升孢子懸浮液的孢子含量，即可將2-3種菌種倒入一個錐形瓶中進行孢子粉碎和離心分離，最后用無機鹽溶液或營養(yǎng)液（含無菌水） 將孢子懸浮液稀釋(如GB2423.16中規(guī)定用無菌水

31、或營養(yǎng)液將孢子懸浮液稀釋至500ml)。 以上工作完成后，應立即對霉菌培養(yǎng)室、超凈工作臺以及制備用具進行滅菌，滅菌方法見（附錄A）。三、試驗1、樣品接種及滅菌將配制好的混合孢子懸浮液倒入喉頭噴霧器中，以細霧狀將混合孢子懸浮液噴到試驗樣品及對照樣品的所有暴露的表面上，噴到液珠凝露但不滴落為止。噴菌結束后，立即關上箱門，檢查記錄設備的運行狀態(tài)和顯示數(shù)據(jù)。并立即對室內及使用后的物品進行滅菌處理（滅菌方法見附錄A）。2、對試驗箱的工作狀態(tài)實施監(jiān)控，使施加標準規(guī)定的試驗條件于設定的容差的范圍內。3、換氣及檢查長霉情況樣品在接種后的第七天，打開外箱門，從玻璃觀察窗外檢查對照樣品的長霉情況，若霉菌覆蓋面積大

32、于90%，試驗繼續(xù)進行；若小于90%則停止試驗。4、孢子活力檢查7天后，從恒溫箱中取出各菌種培養(yǎng)皿觀察。任一試驗菌種在培養(yǎng)皿平板內應生長正常。否則，使用該混合孢子懸浮液進行的試驗無效。5、試驗中斷處理在試驗中，如發(fā)現(xiàn)停電或試驗設備出現(xiàn)故障而中斷試驗時，應根據(jù)不同標準規(guī)定的試驗中斷處理方法來處理，同時做好記錄。四、樣品出箱及最終檢測1、 樣品外觀檢查試驗結束后，試驗箱關機。這時逐件將樣品取出，檢查長霉情況，試驗箱相對濕度保持不小于70%。先用肉眼檢查樣品的長霉程度，若肉眼看不清楚，就借助放大鏡進行檢查，并記錄霉菌生長的部位、復蓋面積、顏色、生長形式、生長密度和生長厚度；觀察產品外觀受霉菌侵蝕的面

33、積比例來確定，嚴格的分級要求各標準中都很具體。2、 試驗結果等級評定（表5）將外觀檢查結果與試驗前情況比較，并按各試驗標準所依據(jù)的長霉等級進行逐一評定長霉等級，必要時可拍攝照片并存檔。3、 對照樣品的檢查對照樣品的長霉程度如要比第7天時減弱，則試驗無效。五、出具試驗報告及資料歸檔 要詳細、清楚、真實地記錄和整理各種試驗原始資料，出具試驗報告。辦理樣品交接手續(xù)后交付試驗樣品，后完成資料歸檔。表5 軍用和民用航空設備長霉等級評定表等級長霉程度長霉情況說明GJB150.10-86HB5830.13-860不長霉未見霉菌生長無霉菌生長1微量長霉霉菌生長和繁殖稀注或局限。生長范圍小于試驗樣品總面積10%

34、，基質很少被利用或未被破土。幾乎未發(fā)現(xiàn)化學、物理與結構的變化。霉菌生長和繁殖稀少或局限2輕微長霉霉菌的菌落斷續(xù)蔓延或松散分布于基質表面，霉菌生長占總面積30%經(jīng)下，中量程度繁殖。有斷續(xù)蔓延或松散布著的菌落，霉菌中等程度繁殖。3中等長霉霉菌較大量生長和繁殖，占總面積70%以下，基質表面呈現(xiàn)化學、物理結構變化。霉菌較大量生長繁殖，試驗樣品呈現(xiàn)化學、物理和結構變化，試品被霉菌覆蓋面占上31%70%。4嚴重長霉霉菌大量生長繁殖，占總面積70%以上，基質被分解或迅速劣化變質。霉菌大量生長繁殖，試驗樣品被分解或迅速變質，試品被霉菌覆蓋面積占71%100%。GB/T2423.16-99GJB4.10-830

35、在標稱放大約50倍下無明顯長霉肉眼看不到試驗樣品表面有霉菌生長。1肉眼看不到或很難看到長霉，但在顯微鏡下可見明顯長霉。試驗樣品表面有微量菌絲生長，或有極少量的直徑小于1毫米的霉斑。2肉眼明顯看到長霉，但在樣品表面的覆蓋面積小于25%。試驗樣品表面有稀疏網(wǎng)狀的菌絲生長,分布或有少量的直徑約23毫米的霉斑，生長區(qū)面積小于25%。3肉眼明顯看到長霉，在樣品表面的覆蓋面積大于25%。試驗樣品表面菌絲呈茂密的絨毛狀覆蓋層或有大量霉斑分布面積大于50%。附錄A滅菌方法（包含整個霉菌試驗過程中的滅菌方法）在霉菌試驗過程中有許多步驟是要求無菌操作的，因此滅菌是整個試驗中的重要環(huán)節(jié)。滅菌的徹底與否將直接影響試驗

36、結果的準確程度，能否確切地反映霉菌試驗的真實情況，也是關系到試驗結果的可靠性。常用滅菌方法有熱力滅菌、化學滅菌及物理滅菌。一、 熱力滅菌1、 干熱滅菌1.1高溫箱（恒溫箱）滅菌 恒溫箱主要是用來培養(yǎng)霉菌菌種、檢測培養(yǎng)皿、菌種分離、孢子活力檢查等。我們在恒溫箱空閑時，就要對恒溫箱進行滅菌。恒溫箱滅菌時，溫度要緩慢的上升（右邊大旋鈕放在INCUBATOR位置）升到160180時保持4小時（常用165）。滅菌后溫度要逐漸下降到60以下再打開箱門,慢慢地再讓箱內溫度下降到最低.1.2酒精燈滅菌在菌種移植、分離及培養(yǎng)時用的接種針（環(huán)）、試管口、倒平板以及金屬工具如刀、剪、鑷等的滅菌在酒精燈的火焰上燒；也

37、可用酒精浸過后在火上將酒精燒去，連續(xù)數(shù)次即可。都能達到滅菌目的及保證無菌操作。2、 高壓濕熱蒸氣滅菌主要是利用高壓蒸氣的滅菌作用，它有較大的滲透力，容易使蛋白質凝固和變性。高壓濕熱蒸氣滅菌是一種可靠的滅菌方法，提高滅菌鍋內蒸氣溫度來達到滅菌目的。它能殺死一切微生物。它的特點是殺菌可靠、經(jīng)濟、快速、無嗅、無味和無毒性，能達到安全有效。 滅菌時，先在滅菌鍋的底部放入適量的清水（水剛溫過電阻絲）這時將待滅菌的器皿以及被霉菌污染的物品用紙（牛皮紙、舊報紙）包裝好，放入高壓滅菌鍋內，用報紙把整個鍋內蓋好,然后蓋上蓋，旋緊鍋蓋關閉放氣閥。把電壓調到220V開始加熱，等壓力在0.05Mpa下面一格時，將放氣

38、閥緩慢的打開，這時鍋內的冷氣一點一點的排除掉,直到冷氣完全排盡(蒸氣從氣門有力的沖擊)關閉氣門,隨之壓力上升,直到指針到0.105Mpa為止，鍋內溫度121，時間保持在30min）。電壓調至140V，保持30min，開始計算時間。滅菌時間即將結束時，停止加熱，讓滅菌鍋自行降壓，等壓力鍋指針回到接近零時即可開啟放氣閥，使鍋內蒸氣排空，然后揭蓋取出已滅菌的物品。 滅菌過程中，由于蒸氣的冷凝，使滅菌物品的包皮受潮容易發(fā)生再污染，因此從滅菌鍋中取出滅菌物品前應設法在鍋內干燥后，再取出物品。 其滅菌的步驟如下： 預熱 排除鍋內冷空氣 關閉放氣閥 滅菌（達到滅菌壓力恒壓保持） 排氣（打開放氣閥） 干燥 結

39、束。凡是在霉菌試驗中所有用過的物品都應先在高壓蒸氣滅菌后方可洗滌，當物品過于污濁或壓力蒸氣鍋內空氣未被完全排除時，此方法滅菌無效，須重新滅菌。二、化學滅菌 化學滅菌即利用化學藥劑進行滅菌。在霉菌試驗中一般用于被霉菌污染過的物品，如試驗箱、試件、衣物以及試驗箱周圍被污染的環(huán)境滅菌。常用化學殺菌劑的濃度及應用范圍見表6：表6 常用化學殺菌劑的濃度及應用范圍序 號名 稱常用濃度應用范圍 1乙醇75%95%噴灑、浸泡、擦拭、皮膚及器械消毒 2次氯酸鈉溶液常溫24下，蒸餾水稀釋1:9(10000ppm)噴灑、擦拭、浸泡 3來蘇兒2%5%（稀釋25倍）空氣消毒、噴灑及擦拭室內的桌面、椅子 4重鉻酸鉀（工業(yè)

40、用）濃H2SO4(工業(yè)用)100ml重鉻酸鉀(工業(yè)用)50g自來水850g移液管、玻璃棒、試管刷及難以清洗的器具三、物理滅菌（輻射滅菌）物理方法滅菌是利用紫外線燈照射。霉菌對紫外線敏感，對之抵抗力強，霉菌大于細菌550倍，較長時間照射也能殺死霉菌和破壞毒素。紫外線照射時不可以超過1.2米為宜，為了加強滅菌效果，在開紫外線燈之前，可先在無菌室內噴灑2%5%的來蘇兒溶液，照射時間應在4小時。紫外線對人體有害，不能直視開著紫外線燈。四、霉菌試驗過程中采用的滅菌法1、玻璃器皿滅菌法玻璃器皿可采用高壓濕熱蒸氣滅菌、化學（藥劑）滅菌。在試驗前對用牛皮紙或舊報紙包裝好的所需玻璃器皿和在試驗后被霉菌污染過的玻

41、璃器皿及物品放入高壓濕熱蒸氣滅菌鍋內，上面覆蓋一層舊報紙，滅菌鍋指針到0.105Mpa，鍋內溫度121，電壓調至140V，保持20min。試驗后滅菌過的玻璃器皿放入1:9(1000ppm)次氯酸鈉溶液中浸泡30分鐘后洗刷干凈并用舊報紙包裝好后備用。3、 培養(yǎng)基（或接種液）滅菌法培養(yǎng)基和接種液一般采用高壓蒸氣滅菌法，將裝有培養(yǎng)基或接種液的試管塞好棉塞，用舊報紙包好后放入高壓鍋內，上面覆蓋一層舊報紙，以免蒸餾水落下打濕棉塞，然后進行滅菌。注意玻璃瓶或試管中盛培養(yǎng)基的量不宜過滿，以容器的為宜，量太多滅菌不易徹底，在滅菌后放氣時培養(yǎng)基的溫度下降速度往往比較滅菌鍋溫度的下降稍慢，如放氣過快培養(yǎng)基過滿，培

42、養(yǎng)基可因沸騰而沾濕棉塞。查氏培養(yǎng)基與接種液需在鍋內溫度121，滅菌鍋指針到0.105Mpa，電壓調至140V，保持30min。馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基需在鍋內溫度121，滅菌鍋指針到0.105Mpa，電壓調至140V，保持30min。4、 被霉菌污染過的物品滅菌法被霉菌污染過的物品如試管、器皿、衣物、小金屬械等均可采用高壓蒸氣滅菌，鍋內溫度121，滅菌鍋指針到0.105Mpa，電壓調至140V，保持30min。5、 無菌室、霉菌試驗箱（室）的滅菌無菌室、霉菌試驗箱（室）的滅菌采用化學、紫外線燈照射滅菌法。無菌室應在每周一次用2%5%濃度的來蘇兒溶液來擦拭超凈工作臺內包括接種針（環(huán)）、桌面、椅子，然后室

43、內用紫外線燈照射4小時。 霉菌試驗箱（室）在入箱后用酒精擦拭箱門把手、室內開紫外線燈照射4小時。出箱后，均可用1:9(1000ppm)次氯酸鈉溶液、噴灑地面及箱內后，關閉箱門20分鐘后用水沖洗試驗箱，反復兩次即可。附錄B菌種的保藏微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間內使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。常用的菌種保藏方法有：斜面或半固體穿刺菌種的冰箱保藏法，石蠟油封藏法，砂土保藏法，冷凍干燥保藏法和液氮保藏法等。目前我們通常采用斜面冰箱保藏法和石蠟油封藏法二種方法的保藏。一、斜面冰箱保藏法此方法主要是利用低溫來抑制微生物的生

44、命活力。通常是將已培養(yǎng)好的純菌種直接放入25左右冰箱中保藏，使微生物在低溫下維持其緩慢生長。當培養(yǎng)基中營養(yǎng)成份被逐步耗盡后再重新移植于新鮮培養(yǎng)基上，如此間隔一段時間就移植一次，故又稱定期移植保藏法或傳代培養(yǎng)保藏法。一般絲狀真菌約36個月移植一次。二、石蠟油封藏法將醫(yī)用液體石蠟裝入三角瓶中，裝量不超過三角瓶總體積的1/3，塞上棉塞，外包牛皮紙（舊報紙），加壓蒸氣滅菌（121條件下滅菌30min），連續(xù)滅菌二次。在40溫箱中放置二周（或置105110烘箱中烘2小時），以除去石蠟油中水份，使石蠟油變?yōu)橥该鳡睿瑐溆谩?加石蠟油 用無菌滴管吸取石蠟油于菌種管中，加入量以高出斜面頂端或直立柱培養(yǎng)基表面約1

45、cm為宜。如加量太少，在保藏的過程中會因培養(yǎng)基稍露出斜面而逐漸變干。 收藏 棉塞外包牛皮紙，把試管直立放置于25冰箱中保藏，一般可保藏2年。附錄C防護措施由于霉菌中有些菌種對人體是有害的，因此，在霉菌試驗進行過程中，以及在處理做過試驗的試驗樣品時應注意以下幾點：1、 進入無菌室及霉菌試驗室進行試驗操作時,應穿工作服，戴口罩、帽子、橡膠手套及鞋套以防止霉菌孢子弄到皮膚、衣物上或吸入呼吸道內；2、試驗的某些操作如菌種移植、接種、分離、菌種檢查等均應在專用的超凈工作臺或房間中進行。2、 為了減少霉菌與皮膚的接觸，在操作過程中如配孢子懸浮液、接種、噴灑孢子懸浮液、檢查長霉的試驗樣品時皆應帶手套，使用后

46、應滅菌。3、 噴灑孢子懸浮液時均或能吸入霉菌孢子，因此，為了避免吸入霉菌孢子，應帶一個可過濾霉菌孢子的口罩或防毒面具，或在專用設備中進行上述工作。5、培養(yǎng)過霉菌的試管、培養(yǎng)皿等器皿應用高壓蒸氣滅菌后再進行清洗；6、長霉試驗的對比樣件應進行很好的處理。不建議用燃燒法，因為燃燒時煙霧能將孢子帶到空氣中而污染大氣。對比樣件在最后處理前應用高壓蒸汽滅菌法滅菌。7、嚴禁在操作試驗過程中進食，離室前用肥皂洗手；8、每一試驗結束后穿的工作服不應帶出室外，更不應穿在身上到處走動。9、噴菌時要在噴菌箱（室）中進行，防止霉菌孢子擴散到空氣中；10、長霉試驗后，試驗樣品不應亂放，應及時處理。最好集中在一個房間內用7

47、5%90%的酒精擦拭后，再用紫外線滅菌燈進行滅菌4小時或更長時間。附錄B軍用和民用航空設備霉菌試驗用菌種及受影響的材料項 目GJB150.10-86HB5830.13-86試驗菌種及編號受影響的材料黑曲霉 Aspergillus niger 3.3928 在許多材料上廣泛生長，對銅鹽有抵抗性黃曲霉 Aspergillus flavus 3.3950 皮革雜色曲霉 Asprygillus versicolor 3.3885 皮革繩狀青霉 Penicillum funiculosum3.3875,3.3872 織物、塑料、棉織品球毛殼霉 Chaetomium globosum 3.4254 纖維素

48、GJB.150.10A-200X(未實施)黑曲霉 Aspergillus niger AS 3.3928 在許多材料上廣泛生長，對銅鹽有抵抗性土曲霉 Aspergillus terreus AS 3.3935 帆布、紙板、紙宛氏擬青霉 Paecilomyces varioti AS 3.4253 塑料、皮革繩狀青霉 Penicillum funiculosum AS 3.3875,3.3872 織物、塑料、棉織品赭綠青霉 Penicillumochrochloron AS3.4302 塑料、織物短柄帚霉 Scopulariopsis brevicaulis AS 3.3985 橡膠綠色木霉 T

49、richoderma viride AS 3.3942 塑料、織物黃曲霉 Aspergillus flavus 3.3950 皮革雜色曲霉 Asprygillus versicolor 3.3885 皮革繩狀青霉 Penicillum funiculosum 3.3875,3.3872 織物、塑料、棉織品 球毛殼霉 Chaetomium globosum 3.4254 纖維素黑曲霉 Aspergillus niger AS 3.3928 在許多材料上廣泛生長，對銅鹽有抵抗性GB/T2423.16-99黑曲霉 Aspergillus niger AS 3.3928 在許多材料上廣泛生長，對銅鹽有

50、抵抗性土曲霉 Aspergillus terreus AS 3.3935 帆布、紙板、紙出芽短梗霉 Aureobasidium pullulans AS 3.3984 侵蝕涂料與皮革宛氏擬青霉 Paecilomyces varioti AS 3.4253 塑料、皮革繩狀青霉 Penicillum funiculosum 織物、塑料、棉織品赭色青霉 Penicillium ochrochloron AS 3.4302 對銅鹽有抵抗性，侵蝕塑料與紡織品光孢短柄帚霉 Scopulariopsis brevicaulis AS 3.3985 侵蝕橡膠綠色木霉 Trichoderma viride AS

51、 3.3942 塑料、織物GJB4.10-83黑曲霉 Aspergillus niger 3.3928 在許多材料上廣泛生長，對銅鹽有抵抗性薩氏曲霉 Asperaillus sydowi 3.3943宛氏擬青霉 Paecilomyces varioti 3.4253 塑料、皮革球毛殼霉 Chaetomium globosum 纖維素臘葉芽枝霉 Cladosporium herbarum 3.3897康寧木霉 Trichoderma koningii 3.4004 產黃青霉 Penicillium chrysogenum 3.3890 土曲霉 Aspergillus terreus 3.3935 帆布、紙板、紙注：菌種編號為中國科學院北京微生物研究所保藏的菌種編號附錄C一、培養(yǎng)基的制備一、 查氏培養(yǎng)基（Ca）材料和器皿： 瓊脂 器皿：DT100單盤天平（或天平），電爐子，石棉網(wǎng)，燒杯，1000ml的容器，漏斗，試管，玻璃棒等。 其它：PH試紙或F20APH計，牛角匙，棉花，潔凈紗布等。方法和步驟：二、 查氏培養(yǎng)基的成份硝酸鈉（NANO3