生物化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)報告

1、 存車處 生物化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)報告項目名稱：核酸的分離純化及性質(zhì)研究 指導(dǎo)教師： 商亞芳 班 級：食品科學(xué)與工程類13-04班 姓 名：俞海清 學(xué) 號：2013218687 日 期：2015/07/02-07/03 小組成員：俞海清 曾斯棋 核酸的分離純化及其性質(zhì)研究摘要：提取植物組織DNA和動物肝臟的DNA，先要破碎細(xì)胞，然后通過離心獲得沉淀。分理出脫氧核糖蛋白（DNP）。利用陰離子除垢劑（SDS），將蛋白質(zhì)和DNA 分離開來，用氯仿-異戊醇去蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，之后用乙醇將DNA沉淀出來，得到粗蛋白質(zhì)。為了獲得高純度的DNA，采用適量的RNase來降解殘留的RNA，

2、再利用乙醇來提取DNA，重復(fù)多次來獲得較純的DNA。再利用DNA紫外吸收特性測定DNA的純度時，發(fā)現(xiàn)提取出來的DNA純度比較高。利用二苯胺法測定DNA的含量，發(fā)現(xiàn)DNA含量偏低。DNA產(chǎn)率很低。最后采用瓊脂糖凝膠電泳來分離DNA，測定DNA片段的分子質(zhì)量。結(jié)果實(shí)驗(yàn)成功的在紫外線下觀察出了標(biāo)準(zhǔn)DNA條帶以及待測樣品條帶。Abstract: In order to extract the plants DNA and the plucks DNA.we should break cells,then separate the DNP.Use the SDS to break protei

3、n and DNA.Phenol chloroforM isoaMyl alcohol Mixture can make protein denaturation .place it on the centrifugal machine to remove the protein .Then,take let the DNA dip into ethylalcohol.it can separate the DNA .In order to obtain high purity DNA, use the right amount of RNase to degradate residual R

4、NA, recycled ethanol to extract DNA over and over again.Using ultraviolet absorption characteristics determine the purity of DNA .we found that the purity of DNA is high.Diphenylamine is used to check the content of DNA, the discovery of DNAs content is low. D

5、NAs yield is very low.Finally, agarose gel electrophores is used to separate DNA and check molecular weight of DNA fragments.Under the uv light,we found standard DNA banding and the banding which belong to pending text sample successfully.關(guān)鍵詞：DNA 分離 二苯胺 乙醇 瓊脂糖凝膠電泳 氯仿-異戊烷Key words：DNA separate diphen

6、ylamine ethylalcohol agarose gel electrophores Phenol chloroforM isoaMyl alcohol Mixture 前言：核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。核酸是由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質(zhì)之一。核酸廣泛存在于所有動植物細(xì)胞微生物體內(nèi)，生物體內(nèi)的核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)，還是功能研究，首先需要對核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。在核酸分離提取中最重要的是要防止核酸的生物降解,細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸的磷酸二酯鍵

7、，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。實(shí)驗(yàn)原理：1.植物組織中核酸的分離與純化原理：DNA存在于細(xì)胞核中，天然狀態(tài)的DNA大多數(shù)是以脫氧核糖核蛋白的形式存在，從細(xì)胞中提取DNA時，一般先獲得脫氧核糖（DNP），在將蛋白質(zhì)除去。陰離子去垢劑SDS可使DNA與蛋白質(zhì)分離，再用含少量的氯仿去蛋白質(zhì)，最后用乙醇把DNA從抽提液中沉淀出來。DNP與核糖核蛋白（RNP）在不同濃度的電解質(zhì)溶液中溶解度差別很大，利用這一特性可將二者分離。以NACL為例RNP0.14mol/LNACL中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度僅為純水中的1%；當(dāng)NACL濃度逐漸增大時，RNP

8、的溶解度變化不大，而DNP的溶解度則隨之增加；當(dāng)NACL的濃度為1mol/L時，DNP的溶解度最大，為純水中溶解度的2倍，因此通?？捎?mol/LNACL提取DNA。進(jìn)一步制備高純度的DNA,可用適量的RNase處理提取液，以降解DNA中摻雜的RNA.為了防止提取過程中DNA被細(xì)胞中釋放出來的DNase 降解以及DNA變性，整個提取過程應(yīng)該在低溫度下進(jìn)行，同時可在研磨緩沖液中加檸檬酸三鈉和Na2-EDTA抑制DNase的活性。提取的DNA是否為純凈，雙鏈，高分子化合物，一般要通過紫外吸收，化學(xué)測定和電鏡觀察等方面的鑒定，本實(shí)驗(yàn)采用紫外吸收法。2. 肝臟中DNA的提取及純度鑒定原理：在細(xì)胞核內(nèi)，

9、核酸通常是與某些組織蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物-核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白形式存在的，因此，在制備核酸時，需先將組織或細(xì)胞勻漿或破碎，使之釋放出核蛋白，再設(shè)法將這兩大類蛋白分開，再通過蛋白質(zhì)變性如苯酚，氯仿等，去垢劑如十二烷磺基硫酸鈉或使用蛋白酶處理，除去蛋白質(zhì)，使核酸與蛋白質(zhì)分離，從而將核酸與蛋白質(zhì)分離開。RNP和DNP在不同濃度的電解質(zhì)溶液中的溶解度差異很大。如在高濃度氯化鈉（12mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小。在低濃度氯化鈉溶液中（0.14mol/L）,DNP的溶解度很小，RNP的溶解度很大。因此，可以利用不同濃度的氯化鈉，將兩者分離。將抽提得到的核蛋白用

10、SDS或苯酚處理使核蛋白解聚，DNA/RNA及與蛋白質(zhì)分開；用氯仿-異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA則溶解于溶液中。經(jīng)上述分離純化后的核酸鹽溶液，再利用其不溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，而使其在適當(dāng)濃度的親水有機(jī)溶劑（如乙醇）中呈絮狀沉淀析出。重復(fù)進(jìn)行上述處理，即可制成所要求純度的脫氧核糖核酸制品。提純的DNA或DNA鈉鹽為白色纖維狀固體。為了防止DNA酶解，提取時加入EDTA。因?yàn)镋DTA是抑制DNA酶活性最好的抑制劑之一，由于DNA酶的酶解作用必須有Ca2+及Mg2+的存在，故只要在提取液中加入少量的金屬螯合劑EDTA，就可使DNA酶失活。本實(shí)驗(yàn)采用動物新鮮肝臟為提取DNA的材料，通過組織勻漿，使細(xì)

11、胞破碎，利用RNP和DNP在一定濃度氯化鈉溶液中溶解度不同的特點(diǎn)，提取DNP。用SDS使蛋白質(zhì)變性和核蛋白解聚，釋放出DNA。用氯仿使蛋白質(zhì)變性沉淀，離心去除。用乙醇作沉淀劑，得到較純的DNA。用Rnsae去除RNA，再用氯仿使酶蛋白變性沉淀，離心去除，最后用乙醇作沉淀劑，得到更純的DNA。DNA純度鑒定需要測定A260，A230和A280的值，經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，高純度DNA樣品A260/A280的值在1.9左右，當(dāng)比值高時說明樣品中混雜有RNA，當(dāng)比值低時表明樣品中蛋白質(zhì)沒有脫凈；而A260/A230應(yīng)大于或等于2.0，若比值過小則表明有雜質(zhì)（一般多酚類或色素）。因此，可利用A260/A280和

12、A260/A230比值的大小來鑒定DNA樣品的純度。3. 二苯胺法測定核酸的含量原理：脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在酸性環(huán)境中變成羥基酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在595nm處有最大的吸收，在每毫升含DNA20400微克范圍內(nèi)，光密度與DNA的濃度成正比，在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)的靈敏度。除DNA外，脫氧木糖，阿拉伯糖也有同樣的反應(yīng)。DNA HO CH2C CH2 CHO 藍(lán)色化合物= 酸性條件 二苯胺 O 羥基酮基戊醛4. DNA的瓊脂糖凝膠電泳原理：DNA分子在堿性環(huán)境中（pH8.3緩沖液）帶負(fù)電荷，外加電場作用下，向正極泳動。不同的DNA片段由于其電荷、分子量大小

13、及構(gòu)型的不同，在電泳時的泳動速率就不同，從而可以區(qū)分出不同的區(qū)帶，電泳后經(jīng)溴乙錠染色，在波長254nm紫外光照射下，DNA顯橙紅色熒光。瓊脂糖凝膠電泳對DNA的分離作用主要依據(jù)DNA的分子量及分子構(gòu)型，同時與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。一定大小的DNA 片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，電泳遷移率不相同。不同濃度的瓊脂糖凝膠適宜分離DNA片段大小范圍見表1。因而要有效分離大小不同的DNA片段，主要是選用適當(dāng)?shù)沫傊悄z濃度。不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。在分子量相當(dāng)?shù)那闆r下，不同構(gòu)型的DNA移動速度次序如下：共價閉環(huán)DNA直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。在同一濃度的凝膠中，分子量較

14、小的DNA片段比較大的片段快。DNA片段的遷移距離（遷移率）與它的大?。ǚ肿恿浚┑膶?shù)成反比。將未知DNA的遷移距離與已知分子大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)物的電泳遷移距離進(jìn)行比較，即可計算出未知DNA片段的大小。瓊脂糖凝膠濃度/%可分辨的線性DNA大小范圍/kb0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.1表5-1 DNA大小范圍與瓊脂糖凝膠濃度的關(guān)系1.實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：1.實(shí)驗(yàn)試劑（1） 以小白菜為材料提取DNA（2） 研磨緩沖液：1mol/氯化鈉，0.045mol/L 檸檬酸三鈉鹽，0.1mol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽（Na2-EDTA），

15、1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）,并調(diào)到PH=7.0.（3） 氯仿-異戊醇（V/v）：氯仿：異戊醇=24:1（4） 95%乙醇溶液（5） RNase溶液（6） TE溶液：含10mmol/L的Tris-HCL, 1mol/L的Na2-EDTA。動物新鮮肝臟（豬）。（7） 4mol/L 氯化鈉溶液：將233.84g氯化鈉溶于水，稀釋至1000mL.（8） 0.14mol/L氯化鈉-0.15mol/L乙二胺四乙酸鈉溶液：溶解8.18g氯化鈉及37.2g 乙二胺四乙酸鈉于蒸餾水，稀釋至1000mL。（9） 10%的SDS溶液：25g 十二烷基硫酸鈉溶于100mL 蒸餾水中。（10） 15mol/L氯化鈉

16、-1.5mol/L檸檬酸三鈉溶液：0.88g氯化鈉和0.44g檸檬酸三鈉溶于蒸餾水中，稀釋至1000mL. (11) 1.5mol/L氯化鈉-0.15mol/L檸檬酸三鈉溶液：87.66g氯化鈉和44.12g檸檬酸三鈉溶于蒸餾水中，稀釋至1000mL.（12）溶液（10mg/mL）：將RNaseA 10mg 溶解于1mL TE 緩沖液中。（13）70%乙醇，95%乙醇。（14）DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液：取小牛胸腺DNA用0.1N氫氧化鈉溶液配制成200微克/毫升的溶液。（15）DNA樣品液：（自己提?。┛刂破銬NA含量在50100微克/毫升左右。（16）二苯胺試劑：稱取1克結(jié)果的二苯胺試劑溶于100毫升

17、分析純的冰醋酸中，再加入10毫升過氯酸（A.R60%以上）或濃硫酸2.75毫升，混勻備用。臨用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液應(yīng)保存于冰箱，一周內(nèi)可使用）所配得的溶液應(yīng)為無色。（17） 限制性內(nèi)切酶Hind試劑盒 （18） 標(biāo)準(zhǔn)DNA：按使用說明配制（19）標(biāo)準(zhǔn)pBR322：按使用說明配制（20）電極緩沖液（5×TBE）：用前稀釋10倍稱取10.88克Tris，5.52克硼酸，0.74克EDTA·Na2·2H2O，溶解后用蒸餾水定容至200ml。使用前用蒸餾水稀釋10倍，稱為TBE稀釋緩沖液（0.5×TBE）。（21）溴乙錠（EB）染色貯存液（1m

18、g/ml）：1滴/組將100mg溴乙錠溶于蒸餾水或電極緩沖液100ml，棕色瓶內(nèi)封好，避光保存。EB是誘變劑，配制和使用時應(yīng)戴乳膠手套，并且不要將該溶液灑在地面或桌面上。凡是沾污過EB的器皿或物品，必須經(jīng)專門處理后，才能進(jìn)行清洗或棄去。（22）1%瓊脂糖2.實(shí)驗(yàn)器材 離心機(jī)；752紫外分光光度計，研缽，三角瓶，燒杯，玻璃棒，勻漿器，離心管，恒溫水浴箱（60度，100度），量筒，吸量管，真空干燥器，紫外分光光度計，石英比色皿，電泳儀，電泳槽，微量移液器，紫外檢測燈，移液管（1、2、5ml）,試管及試管架，凝膠塑料托盤，大小燒杯，一次性塑料手套，紫外反射投射儀，洗瓶，膠頭滴管，卡尺。 操作步驟：1

19、.植物組織中DNA的提取及純度鑒定（小白菜）（1）從冰箱取出冷凍30min以上的小白菜幼嫩組織剪碎，放入研缽中并加入12ml研磨緩沖液研磨成勻漿。（2）將勻漿倒入三角瓶內(nèi)，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，充分震蕩半分鐘，以脫組織蛋白，然后離心（10000r/min）5min，小心地吸出上層清液備用，棄去中下層含有細(xì)胞碎片，變性蛋白質(zhì)，氯仿等殘物。該過程循環(huán)23次（3）將收集的上層溶液倒入三角瓶中，再加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，充分震蕩半分鐘，以脫組織蛋白，然后離心（10000r/min）5min，用吸管吸出上層核酸水同液，移于燒杯中。（4）用吸管沿?zé)诰従徏尤?倍體積預(yù)冷95%的乙醇，然

20、后用玻璃棒輕輕攪動，將出現(xiàn)的纖維沉淀纏繞在玻璃棒上。（5）將上述沉淀溶解在PH=8.0, 2ml的TE溶液中，攪拌到完全溶解后，加入RNase溶液，使其最終濃度為50-75ug/mL,在37度下保溫30min，以除去RNA，然后加入等體積氯仿-異戊醇混合液，在三角瓶中，震蕩半分鐘，離心（10000r/min）5min。收集上層水溶液，再次除去殘留的蛋白質(zhì)和所加的RNase.(6) 按照4的程序加乙醇后，將DNA沉淀挑出(若是無法挑出DNA沉淀，則離心5min （10000r/min），棄去上清液，底部為DNA沉淀)，再將DNA溶解于PH=8.0的2ml的TE溶液中，即得到純化的DNA溶液。（7

21、）DNA純度測定。采用DNA紫外吸收特性進(jìn)行測定，取少量樣品，加PH=8.0的TE溶液稀釋至一定濃度，測A260和A280的值，如A260/A280=1.8，蛋白質(zhì)含量不超過1.3%，DNA純度合乎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 NDA濃度（ug/mL）=×稀釋倍數(shù)（L為比色杯厚度，一般為1cm; 0.020為每mL溶液中含1ugDNA鈉鹽時的吸光值；A260為260nm波長處光吸收值）2. 肝臟中DNA的提取及純度鑒定（1） 取新鮮肝臟（約10g）,用0.14mol/L氯化鈉-0.15mol/L乙二胺四乙酸鈉溶液洗去血液，剪碎，加入10mL 0.14mol/L氯化鈉-0.15mol/L乙二胺四乙酸鈉溶

22、液,置勻漿器中研磨，待研成糊狀后，漿糊狀物離心5min（10000r/min）,棄去上清液，沉淀用0.14mol/L氯化鈉-0.15mol/L乙二胺四乙酸鈉溶液洗2-3次。（2） 向上述沉淀物加入0.14mol/L氯化鈉-0.15mol/L乙二胺四乙酸鈉溶液，使總體積為4mL,然后滴加10%SDS溶液0.5mL,邊加邊攪拌。加畢，置60度水浴保溫10min(用細(xì)玻璃棒經(jīng)常攪拌)，等溶液變得粘稠時（可能不明顯）取出冷至室溫。此步操作系使大分子脫氧核糖核蛋白從細(xì)胞核中溶出，核酸與蛋白質(zhì)分離。（3） 加入4mol/L氯化鈉溶液1.6mL,使氯化鈉最終濃度達(dá)到1mol/L攪拌10min，加入約1倍體積

23、的氯仿-異戊醇混合液，震搖20min，離心5min（10000r/min）.收集上層水相，去掉在氯仿與水相之間的變性蛋白質(zhì)沉淀；向上層水相徐徐加入1.5-2倍預(yù)冷的95%乙醇，DNA沉淀即析出，離心5min（10000r/min）去掉上清，收集沉淀（DNA粗品）。（4） 將DNA粗品置于2.7mL0.015mol/L氯化鈉-0.0015mol/L檸檬酸三鈉溶液中溶解，再加入0.3mL1.5mol/L氯化鈉-0.15mol/L檸檬酸三鈉溶液,攪勻，加入1倍體積的氯仿-異戊醇混合液，震搖10min，離心5min（10000r/min），小心地吸取上層水相（含NDA鈉鹽），棄中層變性蛋白；收集上層水

24、相再加入一倍體積的氯仿-異戊醇混合液，震搖10min，離心5min（10000r/min），小心地吸取上層水相，棄中層變性蛋白。反復(fù)幾次直到中間層蛋白凝膠層消失。向收集的上層水相加入2倍體積預(yù)冷的95%乙醇，DNA即沉淀析出。離心5min（10000r/min），棄去上清液，沉淀為較純的DNA.（5） 將上述所得沉淀溶于2mLTE緩沖液中，加入RNaseA溶液至終濃度為20mg/L混勻，在37度水浴中保溫30min。（6） 向經(jīng)RNaseA 消化后的DNA溶液中加入1倍體積的氯仿-異戊醇混合液，震搖5min，離心5min（10000r/min），小心地吸取上層水相（含DNA），棄中層變性蛋白,

25、重復(fù)抽屜2-3次。（7） 向除盡蛋白質(zhì)的上清液中徐徐加入2倍體積預(yù)冷的95%乙醇，DNA及沉淀析出。離心5min（10000r/min），棄去上清液，再用預(yù)冷的70%乙醇洗一次，室溫倒置干燥。（8） 將上步所得更純的DNA沉淀溶于2mL 0.015mol/L氯化鈉-0.0015mol/L檸檬酸三鈉溶液中備用（供定性鑒定或定量測定）。（9） 將DNA樣液適當(dāng)稀釋，移入光徑為1cm的石英比色皿，并以0.015mol/L氯化鈉-0.0015mol/L檸檬酸三鈉溶液作為空白對照。在紫外分光光度計上分別于260nm,280nm和230nm波長處進(jìn)行測定，計算A260/A280和A260/A230比值的大

26、小來鑒定DNA樣品的純度。3. 二苯胺法測定核酸的含量（一）DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取8支試管，編號，按下表加入試劑 管號 試劑01234567DNA標(biāo)準(zhǔn)液00.20.40.81.01.21.62.0蒸餾水21.81.61.21.00.80.40二苯胺試劑44444444加畢，搖勻，于60恒溫水浴中保溫1小時，（或于沸水中煮沸15分鐘，冷卻測0.D595nm值。）以光密度為縱坐標(biāo)，DNA含量（ug/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）樣品的測定取2支試管，各加0.2ml待測液加蒸餾水稀釋至2毫升，再加4毫升二苯胺試劑，搖勻，其操作步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作相同。根據(jù)測得的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)該

27、光密度DNA的含量，按下式計算出樣品中DNA的百分含量。DNA含量/毫升待測液=標(biāo)準(zhǔn)曲線查得值×稀釋倍數(shù)4. DNA的瓊脂糖凝膠電泳（實(shí)驗(yàn)一，二樣品）一、DNA電泳樣品制作取2只清潔、干燥、無菌的Eppendorf管，編號，分別加入25L樣品溶液，然后加入5L 6×電泳緩沖液，混勻，放入冰箱保存。 二、1.0%瓊脂糖凝膠板的制備1. 用配套擋板將凝膠塑料托盤短邊缺口封住，置水平玻板或水平工作臺面上，將樣品槽模板（梳子）插進(jìn)托盤長邊上的凹槽內(nèi)（距一端約1.5cm），梳齒底邊與托盤表面保持0.5-1mm的間隙，安置好后保持靜置狀態(tài)。圖5-1 凝膠托盤的組裝1. 托盤 2. 擋板

28、 3. 梳子2. 稱取0.3克瓊脂糖置于小錐形瓶中，加入30mlTBE稀釋緩沖液，在電爐上（或微波爐中）加熱融化，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生泡沫。3. 待瓊脂糖冷卻至放在手背不覺太燙手（約60）后，滴一滴EB，然后將瓊脂糖溶液在靠近擋板一側(cè)連續(xù)地倒入托盤內(nèi)（注意中間不要間斷），使凝膠緩慢而連續(xù)地展開直至在托盤表面形成一層約3mm厚均勻膠層（7.1×9.0cm）。膠內(nèi)不要存有氣泡，室溫下靜置約20分鐘。4. 待凝固完全后，雙手均勻用力輕輕拔出樣品槽模板（注意勿使樣品槽破裂），則在膠板上形成相互隔開的樣品槽。5. 取下封邊的擋板，將凝膠連同托盤放入電泳槽平臺上，倒入大量TBE稀釋緩沖液直至浸沒過

29、凝膠面2-3mm，要防止樣品槽內(nèi)窩存氣泡，可以用微量注射器挑除。 三、加樣用微量注射器或移液槍樣品液，分別加入到膠板的不同加樣槽內(nèi)，每個槽（5×2×2.5mm）容積約為25L，因此加樣量不要超過20L，避免因樣品過多而溢出，污染鄰近樣品。加樣時，注射器針頭穿過緩沖液小心靠近加樣槽底部，但不要損壞凝膠槽，然后緩慢地將樣品推進(jìn)槽內(nèi)，讓其集中沉于槽底部。加完一個樣品后的微量注射器應(yīng)反復(fù)洗凈后才能用以加下一個樣品。四、電泳加樣完畢，將靠近樣品槽一端連接負(fù)極，另一端連接正極（千萬不要搞錯），接通電源，開始電泳。在樣品進(jìn)膠前可用略高電壓，防止樣品擴(kuò)散，樣品進(jìn)膠后，應(yīng)控制電壓降不高于5V

30、/cm。當(dāng)染料帶移動到距離凝膠末端約1cm時，停止電泳。五、觀察小心地取出凝膠置托盤上，將膠板推至預(yù)先浸濕并鋪在紫外燈觀察臺上的玻璃紙內(nèi)，在波長245nm紫外燈下進(jìn)行觀察。DNA存在的位置呈現(xiàn)橘紅色熒光，可觀察到清晰的條帶。觀察時應(yīng)帶上防護(hù)眼鏡，避免紫外燈對眼睛的傷害。六、制作測定分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線用卡尺量出DNA-Hind酶解各片段的遷移距離（cm），以DNA酶解各片段分子量為縱坐標(biāo)，它們的遷移距離為橫坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上連結(jié)各點(diǎn)劃出曲線，即為DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。DNA-Hind酶解各片段大小見表5-2。片段堿基對數(shù)目（kb）道爾頓（×106）1234567823.1309.41

31、96.5574.3712.3222.0280.5640.12515.06.124.262.841.511.320.370.08表5-2 DNA-Hind酶解片段實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1. 植物組織中DNA的提取及純度鑒定波長/nm260280吸光值A(chǔ)1.6140.924比值260（nm）/280（nm）1.7472. 肝臟中DNA的提取及純度鑒定波長230260280吸光值A(chǔ)2.2123.5542.373吸光值比值260（nm）/280（nm）=1.498260（nm）/230（nm）=1.6073. 二苯胺法測定核酸的含量 DNA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制試管標(biāo)號01234567DNA濃度（ug/ml）00.2

32、0.40.81.01.21.62.0光密度A0.000.0160.0330.0730.0930.1140.1520.190 利用二苯胺法測定樣品中核酸含量（在波長為595nm環(huán)境下進(jìn)行紫外吸收，且樣品稀釋了10倍）樣品類型小白菜組織中的DNA肝臟組織中的DNA吸光值A(chǔ)0.0150.024DNA濃度(ug/ml)1.862.79DNA產(chǎn)率（%）0.618*10-40.547*10-44. DNA的瓊脂糖凝膠電泳（實(shí)驗(yàn)一，二樣品）通過瓊脂糖凝膠電泳后將電泳結(jié)果在紫外線下照射觀察出了如圖所示的條帶。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果條帶為最下面的兩條。DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品條帶也成功跑出。Marker小白菜肝臟Marker DN

33、A12345678910111213Mr（kDa）10000800060005000400030002500200015001000750500250Log Mr4.003.903.783.703.603.483.403.303.183.002.882.702.40樣品遷移距離（cm）1.71.81.92.02.12.32.52.83.23.74.14.75.4染料遷移距離（cm）6.2相對遷移率（MR）0.270.290.310.320.340.370.400.450.520.600.660.760.87樣品DNA條帶空心菜DNA條帶動物肝臟DNA條帶樣品遷移距離（cm）5.95.7染料遷移

34、距離（cm）6.86.6相對遷移率MR0.8670.864樣品DNA分子量（Mr）233237分析與討論：1. 小白菜DNA提取實(shí)驗(yàn)的過程中，我們組提取的蛋白沉淀明顯偏少這說明我們對白菜的研磨程度不夠，應(yīng)該把小白菜研磨的更加細(xì)。在這一組實(shí)驗(yàn)的過程中我們組在重復(fù)去除細(xì)胞碎片，變性蛋白質(zhì)，氯仿等殘物時取得上清液不多造成DNA的遺失。所以以后在用玻璃棒纏纖維沉淀時，無法纏繞上。我們組采取了離心的方式將其沉淀在離心管的底部。然后按照實(shí)驗(yàn)步驟去除殘余RNA物質(zhì)。我們組所測得的DNA吸光度比值為1.747，比較接近標(biāo)準(zhǔn)的1.8。我們的提純步驟還是比較成功的。就是所得樣品有點(diǎn)少。2. 在做豬肝臟的提取過程中

35、，肝臟的研磨程度可能不夠精細(xì)，而且肝臟組織比較難研磨，而且還是冷凍的肝臟，所以我認(rèn)為這一點(diǎn)可能有影響。在肝臟重復(fù)洗滌的過程中我們采取了離心的方式來洗滌肝臟沉淀，所以我認(rèn)為這個可以更好地去除上清液的雜質(zhì)。在分離核糖和蛋白質(zhì)的過程中，我們的溶液也并不粘稠。后來我們在進(jìn)行抽取上相水層，去除中層變性蛋白。該過程中我們除雜不夠完善，操作不夠精細(xì)，導(dǎo)致少量中層變性蛋白混入DNA。本次實(shí)驗(yàn)吸取了上次實(shí)驗(yàn)教訓(xùn)，我們的產(chǎn)物量很多。但是除雜不夠完全。在進(jìn)行吸光度測試時，我們稀釋了30倍，但是我們的吸光度依舊偏高，因?yàn)殡s質(zhì)的影響，所以吸光度比值不太接近1.8。3. 我們組在弄DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線時，操作還是滿規(guī)范的，我們

36、最后所得擬合趨勢線的R平方達(dá)到了0.999的精度。然而我們在做樣品的測定時，由于小白菜DNA樣品較少且全為未稀釋樣品，所以我們只取了0.02ml的樣品稀釋十倍，在坐這個實(shí)驗(yàn)時進(jìn)行沸水浴的過程時間超過了15min.可能過度的時間會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。我們在算出的產(chǎn)率中可以看到，第一個實(shí)驗(yàn)中的DNA產(chǎn)率有點(diǎn)偏低，所以第一個實(shí)驗(yàn)雖然純度高但是產(chǎn)率低，在第二個試驗(yàn)中，得到的DNA雖然產(chǎn)率相對于其他組較多但是純度就沒有第一組的高。本組實(shí)驗(yàn)比較成功。4. DNA的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，這個實(shí)驗(yàn)我們犯了錯誤，這個實(shí)驗(yàn)是兩個小組共用一塊膠板的，我們凝膠板的制作的過程還是可以的，但是我們在加樣品之前忘記了對樣品加入6X電泳緩沖液。完全照搬實(shí)驗(yàn)材料上的步驟，導(dǎo)致了第一次失誤，然后進(jìn) 行第二次實(shí)驗(yàn)，在這次實(shí)驗(yàn)過程中因?yàn)椋瑐€人操作原因（手抖），加樣品時將瓊脂糖凝膠刺穿了，加樣品失敗。（上圖中從下向上，第三個膠槽）可以發(fā)現(xiàn)該DNA染料只跑了三分之一不到。然后再第一個膠槽重新加樣。我們組的實(shí)驗(yàn)所用膠槽是從下向上的三個。感覺跑的還可以