細胞生物學(xué)實驗

1、本科學(xué)生綜合性實驗報告學(xué)號 姓名 學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)、班級 實驗課程名稱 細胞生物學(xué)實驗 教師及職稱 開課學(xué)期 至 學(xué)年 學(xué)期 填報時間 年 月 日云南師范大學(xué)教務(wù)處編印實驗序號五實驗名稱人類淋巴細胞株培養(yǎng)實驗時間10.28 11.25實驗室生物綜合實驗室2一實驗預(yù)習(xí)1實驗?zāi)康?一) 細胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗、消毒、滅菌）能獨立地進行用于細胞培養(yǎng)的個中器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。(二) 培養(yǎng)基的配制熟練掌握RPMI 1640培養(yǎng)基的配制方法。(三) 細胞傳代培養(yǎng)1. 熟練掌握細胞傳代培養(yǎng)的操作方法。2. 觀察外培細胞在不同時期的

2、形態(tài)變化及生長狀況。(四) 死活細胞的鑒別掌握死活細胞的鑒別原理及方法。2實驗原理、實驗流程或裝置示意圖(一) 細胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗、消毒、滅菌）1. 清洗與消毒是組織培養(yǎng)實驗的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。2. 體外培養(yǎng)細胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌操作的要求程度很高。細胞培養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。3. 滅菌手段的選擇也十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價值、生物學(xué)特性或其他使用價值也不行。(二) 培養(yǎng)基的配制1. 細胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基一般是由合成培養(yǎng)基和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有

3、商品出售，它是根據(jù)細胞生長的需要按一定配方制成的粉狀物質(zhì)。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和其他輔助物質(zhì)。它的酸堿度和滲透壓與活體內(nèi)細胞外液相似。2. 小牛血清含有一定的營養(yǎng)成分，更重要的是它含有細胞生長所必需的生長因子；酶、微量元素和激素；保護作用；提供伸展和貼附因子等，是合成培養(yǎng)基所無法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)（重金屬、抗菌素）的毒性。3. 氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)基提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。

4、因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。(三) 細胞傳代培養(yǎng) 當(dāng)原代培養(yǎng)細胞或細胞系細胞增殖達到一定密度后，則需要做在培養(yǎng)。一般將傳代培養(yǎng)的累計次數(shù)作為細胞代數(shù)。懸浮型細胞培養(yǎng)常見于淋巴細胞、白血病細胞、骨髓瘤細胞和腹水型惡性細胞等的培養(yǎng)。由于這類細胞或細胞集體可懸浮在液體培養(yǎng)基中，而不附著在固體表面上，因此無論原代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)的細胞增殖過程都沒有貼附性細胞那種明顯可辨的3個變化階段，其培養(yǎng)的可見效果是細胞數(shù)目的增多及溶液中細胞濃度和密度的加大。懸浮型細胞傳代培養(yǎng)的最大特點是原代細胞不必經(jīng)過機械分離或消化酶消化

5、處理，傳代時只須把培養(yǎng)的懸浮細胞做適度稀釋或把培養(yǎng)細胞經(jīng)簡單的離心處理后再加入適量的培養(yǎng)液即可培養(yǎng)。因此，細胞在從原代到傳代的轉(zhuǎn)變過程中遭受的機械損傷和化學(xué)損傷的可能性較少，損傷程度也較輕，相對而言，傳代的成功率較高。(四) 死活細胞的鑒別細胞的存活率是反映細胞群體生活狀態(tài)的重要指標(biāo)。多種方法可以鑒別細胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。原理：許多酸性物質(zhì)不容易穿過活細胞的質(zhì)膜進入胞內(nèi)，卻能滲入死亡的細胞內(nèi)，使其著色，以次來區(qū)別死活細胞。3 實驗設(shè)備及材料(一) 細胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗、消毒、滅菌）（1）儀器超凈工作臺、干燥箱、高壓鍋、過濾器（2）材料微孔濾膜（直徑25mm）：孔徑為0.22

6、um(3）試劑75%酒精、重鉻酸鉀、濃硫酸、NaOH、 HCl等(二) 培養(yǎng)基的配制（1）儀器超凈工作臺 高壓滅菌鍋 多重蒸餾水器 磁力攪拌器 天平微量加樣器（2）材料細胞培養(yǎng)瓶 量筒、研缽、燒杯、漏斗、濾紙 pH試紙微孔過濾器（0.22m）及注射器 各種規(guī)格的Tip 、離心管(3）試劑NaOH、 酚紅 RPMI 1640干粉 小牛血清、青霉素、鏈霉素NaHCO3 、L-谷氨酰胺 三蒸水(三) 細胞傳代培養(yǎng)（1）儀器超凈工作臺 微量加樣器（移液槍） 倒置顯微鏡 光學(xué)顯微鏡高壓滅菌鍋 蒸餾水器 超低溫冰箱 二氧化碳培養(yǎng)箱（2）材料細胞培養(yǎng)瓶 血球計數(shù)板 滴管 培養(yǎng)細胞(3）試劑臺盼藍（染料）乙醇

7、(四) 死活細胞的鑒別（1）儀器人類淋巴細胞株（2）材料0.4%臺盼藍溶液(3）試劑顯微鏡 血球計數(shù)板4實驗方法步驟及注意事項一 細胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗、消毒、滅菌）（一）清洗1.新玻璃器皿的清洗 先用自來水刷洗，再浸泡5%稀鹽酸中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和有害物質(zhì)。2.使用過的玻璃器皿的清洗（1）立即進入清水，避免干涸難洗；（2）用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥；（3）浸酸性洗液過夜；（4）從洗液撈出自來水沖洗1015次去除酸性洗液，蒸餾水刷洗10次，倒置烘干；（5）包裝（牛皮紙或不透水紙）；（6）高壓（15磅20min)或干熱（160度2h)滅菌；（7）備用。（二）膠塞處理（

8、1）新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸1020min。（2）自來水清洗10次（3）用1%稀鹽酸浸泡30min。（4）自來水清洗10次，蒸餾水刷洗10次。晾干（5）舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸清洗數(shù)次，過蒸餾水，晾干，包裝高壓滅菌，可使用。（三）塑料制品的清洗（1）用洗滌劑清洗，自來水沖洗數(shù)遍（2）強（次強）酸洗液浸泡26h.（3）自來水沖洗10次以上，蒸餾水刷洗10次（4）浸泡在70%乙醇0.51h,備用。（5）用前從乙醇中取出，在超級工作臺內(nèi)紫外線照射1h。（四）洗液的配制（1）將重鉻酸鉀6.3g放入大燒杯中，加入蒸餾水20ml放在石棉網(wǎng)上加熱至沸騰并攪拌，使重鉻酸鉀

9、充分溶解。（2）將重鉻酸鉀倒入酸缸中，然后緩慢加入濃硫酸100ml并用一長玻璃棒不斷攪拌，充分溶解。注意事項：操作時注意安全，穿戴好耐酸手套和圍裙，防止洗液飛濺到衣物皮膚上，不慎飛濺到皮膚應(yīng)立即用大量清水沖洗。二培養(yǎng)基的配制（1）合成培養(yǎng)基的配制1. 1%酚紅：配制 0.1 mol/L NaOH 100ml。稱量 1g 酚紅于研缽中，取 30 ml 0.1 mol/L NaOH逐漸加入研缽中，盡量研細，然后過濾。過濾后的酚紅液加三蒸水至 100 ml。4保存。2. 飽和NaHCO3的配制：稱取 10g 的 NaHCO3 溶于 200 ml 三蒸水中，滅菌后分裝于50 ml 試劑瓶。4保存。3R

10、PMI 1640 培養(yǎng)液配制：配制50ml RPMI 1640培養(yǎng)液：每組稱取 RPMI 1640干粉 0.52g，溶于50 ml 的三蒸水。置于攪拌器上攪拌 20 min，直到液體變?yōu)槌吻鍨橹埂?. RPMI 1640 合成培養(yǎng)基配制：加入 0.1ml 1%的酚紅，通入CO2，使液體變?yōu)榻瘘S色，說明培養(yǎng)基完全溶好。配制好的培養(yǎng)基，用時用飽和 NaHCO3液調(diào)節(jié) pH 至 6.8-7.0。溶好以后的培養(yǎng)液在超凈臺中進行0.22m濾過除菌，分裝至細胞培養(yǎng)瓶中。瓶口封好，-20或4 貯存。（2）小牛血清的處理新買的新生小牛血清一定要滅活。將買來的新生小牛血清不開封置于水浴鍋中56，30min，期間

11、要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。處理后的血清貯存于4。（3）生長培養(yǎng)基的配制1雙抗： （100000U/ml）160萬單位青霉素/瓶+8ml 3DW = 20萬單位/ml1g鏈霉素+5ml 3DW = 200000 g /ml各取以上的液體5ml混合，使其濃度為10萬單位/ml，0.22m 過濾至1.5ml離心管，-20貯存。2谷氨酰胺儲備液（200mmol/L）： 1.5g的谷氨酰胺溶于50ml三蒸水中（30 mg/ml= 200 mmol/L),0.22m過濾至1.5ml離心管中。-20貯存。3. RPMI 1640生長培養(yǎng)基的配制50毫升儲備液濃度終濃度RPMI 1640培養(yǎng)液

12、 44.5谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml雙抗0.05100000u/ml100u/ml小牛血清510%三 細胞傳代培養(yǎng)選取擬作傳代培養(yǎng)的樣本，取0.5mL細胞懸浮液加入等量臺盼藍染液，混勻后用血球計數(shù)板計算細胞的成活率。如果樣本成活率高，無污染即可用于傳代。用彎頭吸管將原代培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞吹打均勻，注意將那些半貼壁生長的細胞吹打脫離以免在移換容器時丟失。把細胞懸液吸入無菌離心管中，塞緊反口橡皮塞以防止空氣污染，用1000r/min離心5min。吸去上清夜，加入適量的培養(yǎng)液，用吸管打勻制成細胞懸液。重復(fù)步驟1，計算細胞數(shù)，加入適量培養(yǎng)液把最終細胞數(shù)調(diào)節(jié)至1×1053

13、5;105個/mL。把細胞懸浮分裝至新備的細胞培養(yǎng)瓶中，置于37二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。操作：每小組先用一個培養(yǎng)瓶配制50ml的生長培養(yǎng)基每人取10ml培養(yǎng)基到自己的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)然后向細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)接種400ul的人淋巴細胞株原液放入二氧化碳培養(yǎng)箱，旋松瓶蓋根據(jù)細胞的數(shù)量看細胞瓶是否平放或直立放置觀察倒置顯微鏡的使用方法利用課余時間和下次實驗課時間用倒置顯微鏡進行觀察。四死活細胞的鑒別取20ul細胞懸液放入干凈的離心管中，加入等體積的0.4%的臺盼藍染液混合，放置1min。取一干凈的血球計數(shù)板，蓋上蓋片，從蓋片兩邊滴入細胞懸液使之充滿計數(shù)板和蓋片之間。注意滴液勿有氣泡，也不能太多，否則會使蓋片

14、浮起而是細胞計數(shù)不準(zhǔn)。低倍鏡下觀察，活細胞不著色，臺盼藍著色的細胞呈深藍色，是不健康或已死亡的細胞，不能計數(shù)。找出計數(shù)板上的方格，計算四角大格內(nèi)總的細胞數(shù)，壓著大格線者只計左側(cè)或上方，不計右側(cè)或下方。注意事項1接種的血樣愈新鮮愈好，最好是在采血后24小時內(nèi)進行培養(yǎng)，如果不能立刻培養(yǎng)，應(yīng)置于4存放，避免保存時間過久，會影響細胞的活力。2在培養(yǎng)中成敗的關(guān)鍵，除了至為重要的PHA的效價外，培養(yǎng)的溫度和培養(yǎng)液的酸堿度也十分重要。人的外周血淋巴細胞培養(yǎng)最適溫度為37±0.5。培養(yǎng)液的最適pH7.27.4。3培養(yǎng)過程中，如發(fā)現(xiàn)血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕振蕩，使凝塊散開，繼續(xù)放回37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。4

15、 制片過程中，如發(fā)現(xiàn)細胞膨脹得不大，細胞膜沒有破裂，染色體聚集一團伸展不開，可將固定時間延長數(shù)小時或過夜5.參考文獻1吳昆, 拜合提亞·阿扎提, 王文光, 安尼瓦爾·牙生, 王玉杰. 小鼠骨髓來源樹突狀細胞培養(yǎng)鑒定和誘導(dǎo)T淋巴細胞增殖J. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2011, (08)2 李靜, 郭文文, 羅彬, 陳芳, 王煒煒, 肖紹文, 謝小薰. OY-TES-1誘導(dǎo)的樹突狀細胞對T淋巴細胞的增殖活化作用J. 免疫學(xué)雜志, 2011, (07) 3 史嘉林,楊棟. 細胞培養(yǎng)及避免細胞污染的方法J. 養(yǎng)殖技術(shù)顧問, 2010, (07) .4 朱慶虎,陳弘,秦紅麗

16、,劉蘭剛,康二勇. 動物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器的主要操作模式J. 畜牧獸醫(yī)科技信息, 2010, (10) .5 姚飛. 常用的細胞培養(yǎng)方法、污染及污染處理J. 科技信息, 2009, (07) .6 周麗薇. 細胞培養(yǎng)技術(shù)與防止細胞污染的方法J. 醫(yī)學(xué)信息(上旬刊), 2010, (11) .7 王洪躍,戴曉云. 現(xiàn)代動物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器概述J. 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, (02) .二實驗報告1.實驗現(xiàn)象與結(jié)果第一大格第二大格第三大格第四大格活細胞A4324B28610平均35.547死細胞A0113B1133平均0.5123計算：每毫升原液細胞數(shù) = 4大格細胞總數(shù)/4 × 10000 × 稀釋倍數(shù)細胞存活率（%）=（細胞總數(shù)-死細胞數(shù)）/ 細胞總數(shù)每毫升原液細胞數(shù)=4大格細胞總數(shù)（A、B平均）/4 × 10000 × 稀釋倍數(shù)=（3+5.5+4+7+0.5+1+2+3）/4×10000=65000細胞存活率（%）=（3+5.5+4+7）/（3+5.5+4+7+0.5+1+2+3） =75% 2對實驗現(xiàn)象、實驗結(jié)果的分析及其結(jié)論許多酸性物質(zhì)不容易穿過活細胞的質(zhì)膜進入胞內(nèi)，卻能滲入死亡的細胞內(nèi)，使其著色，以次來區(qū)別死活細胞。死細胞被染成藍黑色，而活細胞是透明的，不容易觀察到。給細胞著色在細胞計數(shù)中，便于區(qū)分死活細胞。停滯期