CFSE的配制和實驗步驟

1、精品在使用前仔細閱讀說明書感謝下載載貨號 規(guī)格C375 1 mg-Cellstain-CFSE熒光染料 CFSE(CFDA-SE) ，是一種可對活細胞進行熒光標(biāo)記的新型染料，可以標(biāo)記活體細胞。其基本原理如下：CFSE是一種帶有琥珀酰亞胺 (NHS)的熒光染料,可以結(jié)合細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。CFSE在結(jié)構(gòu)上將酚羥基部位改造成 AM體，所以自身不發(fā)熒光,熒光背景低，脂溶性高，能夠輕易穿透細胞膜，在活細胞內(nèi)與胞內(nèi)蛋白共價結(jié)合，進入細胞內(nèi)的CFSE 的AM部位能被細胞內(nèi)酯酶水解發(fā)出綠色熒光。CFSE的琥珀酰亞胺(NHS)和細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基部位結(jié)合，固定在細胞內(nèi)，不會漏出細胞外。CFSE進入細胞后定位于細胞

2、膜、細胞質(zhì)和細胞核，在細胞核的熒光最強。在細胞分裂增殖過程中，CFSE的熒光強度會隨著細胞的分裂而逐級遞減，標(biāo)記熒光可 平均分配至兩個子代細胞中， 因此其熒光強度是親代細胞的一半， 根據(jù)這一特性， 它可被用 于檢測細胞增殖，細胞周期的估算及細胞分裂等方面。它常被用來做活體細胞檢測另外，CFSE標(biāo)記的細胞用于體內(nèi)觀察可以長達數(shù)周之久, 實驗和用熒光電鏡觀察細胞長期活動的實驗。建議您在正式實驗前先摸索一下細胞量、 CFSE 的終濃度、培養(yǎng)時間等，找到最佳實 驗條件。配制試劑：1、從冰箱中取出CFSE試劑，放至室溫后再打開。盛放CFSE的管子開蓋前請輕彈管壁幾次,讓粉末充分落入管底，必要時可采用離心

3、的方法。2、lOOOmgCFSE溶解于360ul的DMSO，制成5mM的儲存液，于-20 C避光保存，使用時,用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋成5訓(xùn)的工作液備用。a） DMSO 需要保證新鮮無水，否則將會導(dǎo)致 AM 體水解，使熒光染料無法進入細胞，影響實驗效果。-20 Cb）由于CFSE母液遇水極易分解，所以建議分裝保存，例如分裝成5卩I/管。（方法：分裝后用封口膜密封管口，再用錫箔紙包裹，最后和干燥劑一起用塑料袋密封，W冷凍保存。）C）CFSE工作液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，因為 CFSE吸水會分解，影響染色效果。細胞染色 （僅供參考 ）：例1 培養(yǎng)板觀察法a）71、準(zhǔn)備細胞懸液，用 PBS（-）等合適的培養(yǎng)基

4、調(diào)整細胞濃度至約10個/ ml 。2、取1ml細胞懸液至試管中， 加入適量CFSE工作液，輕輕攪拌混勻 （建議CFSE的終濃度參 考相關(guān)論文或做個預(yù)實驗：分別設(shè)定終濃度為0.5,1,2,5,10,20卩M，以確定最佳染色濃度）。3、在37 C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15-30 分鐘。4、離心后去上清，加入 2 ml PBS 溶液，再離心后去上清，重復(fù)此操作一次。5 、加入合適的培養(yǎng)基制成細胞懸液。6、取500卩I的細胞懸液加在培養(yǎng)孔中，用熒光顯微鏡觀察，看到熒光后，根據(jù)自己實驗的要求調(diào)整細胞數(shù)量C）進行實驗。2 載玻片觀察法a)71、準(zhǔn)備1 ml細胞懸液，用PBS(-)等合適的培養(yǎng)基 調(diào)整細胞濃度至約10個/ ml 。2、取30卩I細胞懸液至試管中，加入10卩I濃度為20卩M的CFSEX作液(終濃度為5卩M ), 輕輕攪拌混勻。o3、在37 C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15-30分鐘。4、滴 10卩l(xiāng)的細胞懸液在載玻片上，用熒光顯微鏡觀察，看到熒光后，根據(jù)自己實驗的要求調(diào)整細胞數(shù)量進行實驗。如果背景高的話，第 3 步之后需要洗去多余的 CFSE：離心后去上清，加入90卩I PBS溶液，再離心后去上清，重復(fù)此操作一次。a)盡可能用不含血清的培養(yǎng)基，血清中的酶和蛋白質(zhì)會分解 CFSE,可能會影響染色效果。b)