腫瘤抗原致敏樹突狀細胞治療膠質瘤的實驗研究

1、腫瘤抗原致敏樹突狀細胞治療膠質瘤的實驗研究        【摘要】     目的 研究腫瘤凍融抗原致敏樹突狀細胞（DC）治療膠質瘤的療效。方法 從大鼠骨髓中分離出單核細胞后，加入添加rGMCSF和rIL4的IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)后鑒定。制備大鼠C6膠質瘤凍融抗原以及DC疫苗，同時腫瘤凍融抗原致敏DC體外細胞毒試驗；建立動物模型，體內應用DC疫苗并觀察療效。結果 單核細胞培養(yǎng)8天后可獲得大量的樹突狀細胞；體外細胞毒試驗發(fā)現(xiàn)對相應的C6腫瘤細胞有明顯的殺傷作用；動物實驗發(fā)

2、現(xiàn)治療組腫瘤生長明顯抑制，而對照組腫瘤明顯生長，兩組腫瘤體積有顯著性差異P<0.01。結論 建立了體外擴增大鼠骨髓DC以及制備DC疫苗的方法,采用凍融抗原致敏DC疫苗治療荷瘤動物生存時間明顯延長，腫瘤生長明顯抑制，為研究其在腦膠質瘤臨床免疫治療打下基礎。     【關鍵詞】  樹突狀細胞；腦膠質瘤；免疫治療；凍融抗原    Experimental Study of Vaccination with Dendritic Cells Pulsed with Tumor Cell Lysates for

3、 Immunotherapy of C6 GliomaLIU Zaiming, LEI Ting, NIU Hongquan, DONG Fangyong, DONG Zheng, WANG Yu, XUE DelinDepartment of Neurosurgery, Tongji hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, ChinaAbstract：Objective  To investigate effect of dendri

4、tic cells pulsed with tumor antigens which are used to treat with intracranial glioma.Methods  dendritic cells were isolated from rat bonemarrow precursors stimulated in vitro with granulocytemacrophage colonystimulating factor (GMCSF) and interleukin4 (IL4).Then mature DCs were analyzed; Produ

5、ce lysates and dendritic cells vaccinum; then we established animal model treated with dendritic cells vaccinum. The rat brains were then removed and examined histologically,and spleens were harvested for cellmediated cytotoxicity assays.Results  Mature dendritic cells with typical cloved leafs

6、haped nucleus and long cytoplasmic dendrites, immunocytochemisty showed expressions of OX6 and OX62 were positive, cellmediated cytotoxicity assays showed that there were statistically significant compared with control cells. At necropsy, the size of neoplasm is larger in tumor than control group (P

7、<0.01).Conclusion A method to generate large number of dendritic cells from rat bonemarrow in vitro and manufacture dendritic cells vaccinum is established, and dendritic cells pulsed with lysate could inhibit significantly the growth of tumor; which may contribute to further study on the role of

8、 them in the immuntherapy of brain glioma.Key words：Dendritic cells;Glioma; Immuntherapy; Tumor lysates0  引言    樹突狀細胞（dendritic cells，DC）作為功能最強的抗原提呈細胞，能激活靜息型T細胞，激發(fā)初始免疫應答。隨著DC體外誘導擴增技術的發(fā)展及分子生物學技術應用于DC瘤苗構建方法的發(fā)現(xiàn)， DC瘤苗有望成為腫瘤免疫治療的一種有效方式。我們建立了利用大鼠骨髓分離培養(yǎng)和鑒定樹突狀細胞以及制備樹突狀細胞疫苗的方法, 并觀察了DC疫苗治療

9、腦膠質瘤的療效，為腦膠質瘤免疫治療提供理論基礎。1  材料和方法1.1  材料和試劑儀器  成年清潔級SD大鼠（雄性），體重(200±20)g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。C6細胞株（同濟醫(yī)院神經外科實驗室提供），IMDM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco 公司），rGMCSF與rIL4（Protechec 公司），SABC免疫組化染色試劑盒(博士德公司)。1.2  大鼠骨髓來源DC的提取和培養(yǎng)  斷頸處死SD大鼠,固定后消毒雙下肢，取出脛、腓骨。以下在無菌臺內操作,70%的乙醇中及PBS漂洗。將脛、腓骨兩端剪

10、掉直止紅骨髓,用IMDM液將骨髓沖出至培養(yǎng)皿中。尼龍濾膜過濾。將過濾后的IMDM懸液離心, 加入紅細胞裂解液, 離心。細胞沉淀加入IMDM完全培養(yǎng)液, 再加入rIL4 (500U/ml,終濃度), rGMCSF (500U/ml,終濃度)。37, 5%CO2濕化培養(yǎng)。接種后2天半量換液, 第4、6 天只補充rIL4, rGMCSF。1.3  大鼠骨髓來源DC的鑒定  分別在第18天用相差顯微鏡觀察DC細胞。取培養(yǎng)8天的細胞離心收集細胞沉淀， 2.5%的戊二醛固定2小時， 漂洗， 置入4預冷的1%餓酸固定2小時， 梯度乙醇脫水， 包埋, 切片染色, 透射電鏡觀察。采用博士德公

11、司即用型SABC免疫組化染色試劑盒, DAB顯色對DC細胞進行免疫組化鑒定； 同時表達OX62+,OX6+的細胞是DC細胞,  嚴格按試劑盒說明進行。1.4  大鼠C6膠質瘤DC疫苗的制備  收集對數(shù)生長期的C6膠質瘤細胞，放入液氮中，10min后取出迅速放入37水浴完全融化再放入液氮中，反復4次。稀釋至1ml，用微孔濾膜過濾，4保存?zhèn)溆谩Ｔ谂囵B(yǎng)4天的DC中加入C6膠質瘤凍融抗原，比例為13。培養(yǎng)至8天收集DC并計數(shù)，既制成大鼠C6膠質瘤DC疫苗。1.5  負載凍融抗原DC動物實驗體外細胞毒試驗(MTT法)  C6膠質瘤細胞制成靶細胞。制備效應

12、細胞, 為單純DC，DC+C6膠質瘤細胞，DC+C6膠質瘤細胞凍融抗原3組。取C6膠質瘤細胞106個接種于大鼠腹部皮下。一周后無菌取荷瘤小鼠脾臟，獲得T細胞。T細胞加RPMI1640液3 ml，10% FCS，IL2 （10U/ml，終濃度），再加入不同的3組效應細胞，DC和T細胞為150。37，5%CO2，濕化培養(yǎng)5天，制成效應細胞CTL。用MTT法檢測：（試劑：MTT工作液，5mg/ml；萃取液以10g SDS + 99.4mlDMSO + 0.6ml乙酸制成）將效靶細胞按101, 51, 2.51加入96孔板, 每孔靶細胞C61500個,總體積100l,37×4h,振蕩培養(yǎng)。每

13、孔加入MTT工作液10l, 37×3h,振蕩培養(yǎng)。吸棄上清60l, 加入萃取液100l, 37×2h,振蕩培養(yǎng)。在酶標儀上檢測各孔OD值，檢測波長550nm,參考波長620nm。CTL殺傷活性=1-實驗組殺傷后靶細胞OD值未殺傷靶細胞OD值×100%1.6  大鼠C6腦膠質瘤動物模型的建立  動物共分3組： A組，大鼠C6腦膠質瘤動物模型治療組； B組， 大鼠C6腦膠質瘤動物模型非治療組； C組， 空白組。A組10只， B組10只， C組5只。 C6腦膠質瘤模型的建立: 稱重， 6%水合氯醛腹腔注射。大鼠麻醉后固定在立體定向手術臺上， 作右前額

14、中線旁3mm直切口， 以自制磨鉆磨開3×3mm大小骨窗。 無菌條件下， 采用立體定向技術， 用微量進樣器向右側頂葉皮層下2mm注射C6細胞106個（10l）。 縫合頭皮， 常規(guī)飼養(yǎng)。 A組大鼠， 在接種后第2天的C6腦膠質瘤動物模型皮下注射大鼠C6膠質瘤DC疫苗0.5ml， 每只注射DC約2×106個。1.7  大鼠腦標本的處理  A組和B組第10天及第20天取腦，C組在第1天取腦。直接取腦后-80凍存制片。以接種的部位為中心冠狀將腦組織分割成三塊，石蠟固定，制作組織病理切片，厚度為5m，常規(guī)HE染色。同時進行組織病理切片圖像分析，顯微鏡下借助圖像分析儀

15、測量腫瘤體積V=L×S2;L和S分別代表腫瘤組織冠狀最大切面的最長徑或最短徑。2  結果2.1  相差顯微鏡觀察  48h后,DC在培養(yǎng)基中呈懸浮生長,含用大量單核細胞和紅細胞；第35天,細胞貼壁生長, 紅細胞大部分消失, 單核細胞比例增加；58天后,大量懸浮細胞形態(tài)不規(guī)則, 細胞有伸展的毛刺。2.2  透射電鏡  成熟的樹突狀細胞大小1520m,胞體呈不規(guī)則形態(tài),細胞表面樹狀突起。2.3  免疫組織化學技術分析  培養(yǎng)的DC細胞第8天,細胞可表達OX62+和OX6+，見圖1A、1B。2.4  腫瘤凍融抗

16、原致敏樹突狀細胞動物實驗體外細胞毒試驗C6抗原DC為88.32%、65.49%、50.93%；C6+DC為30.76%、22.21%、15.38%；DC為20.21%、15.13%、13.67%。統(tǒng)計學分析示C6抗原DC與C6+DC相比P0.01,C6抗原DC和DC相比P0.01。2.5  病理切片結果分析  組織病理切片示實驗組可見腫瘤生長明顯抑制，對照組腫瘤明顯生長，見圖2、3。2.6  動物生存曲線  對照組生存時間(19.76±10.56)天，治療組生存時間(37.68±15.23)天。兩組之間有顯著性差異P<0.01,

17、見圖4。圖4  動物生存曲線（略）2.7  組織病理切片圖像分析  C6細胞接種后10天，20天后實驗組和對照組各取5只大鼠測量腦內腫瘤體積。對照組腫瘤大小(mm3)：10天 56.55±1.38，20天69.73±1.13；實驗組腫瘤大?。?0天 11.78±0.91, 20天 21.78±1.22。統(tǒng)計學分析兩對照組腫瘤體積無顯著性差異（P>0.05）, 兩治療組腫瘤體積無顯著性差異（P>0.05）,而治療組腫瘤體積顯著小于對照組（P<0.01）。3  討論   

18、 DC在機體分布廣泛但數(shù)量極少,它們只占外周血單核細胞的0.5%。DC數(shù)量甚微極大的限制了DC的研究和應用。DC主要來源于骨髓和血液,在不同因素的作用下,分別發(fā)育成為各種類型的DC。Fresnay1報告用GMCSF和IL4體外擴增骨髓來源DC。本實驗選擇了同時用GMCSF和IL4協(xié)同誘導培養(yǎng)大鼠骨髓DC；經過體外培養(yǎng)擴增,從每只大鼠骨髓中可以得到8×107的DC。確定一種細胞是否為樹突狀細胞需從形態(tài)學，特異性標志等多方面來考慮，不同的種屬其表面標志可以不同，大鼠樹突狀細胞的表面標志OX62+，OX6+。OX62為一粘附分子，OX6是MHC II分子。盡管MHC II分子在OX62的某

19、些細胞表達，但表達OX6和OX62的細胞一定為樹突狀細胞。一般認為, 腦組織是免疫特赦部位，據(jù)目前的研究, 腦組織中可能存在樹突狀細胞,一些細胞在某些情況下可以轉化為樹突狀細胞。Nunez2等成功地建立腦組織來源的樹突狀細胞系AG116,將AG116與腫瘤抗原和T細胞一起培養(yǎng),可以促進T細胞增殖和IL2產生, 增加IL6、IL12、p40的分泌。正常情況下,人腦中樹突狀細胞的功能受到抑制,這與其表面不能表CD80、CD86等分子有關3。腫瘤患者體內DC功能缺陷，不能有效遞呈腫瘤抗原，導致免疫無能或免疫耐受，使腫瘤得以發(fā)生發(fā)展4。因此在臨床治療中著重于增加DC的數(shù)量和改善DC的功能,但這必須經過

20、DC的提取,在體外培養(yǎng)、擴增以及加入抗原制成疫苗的過程。將腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原在體外對DC進行致敏,致敏后的DC就可以有效地激活針對表達該抗原腫瘤的CTL細胞的活性，但目前多數(shù)腫瘤包括膠質瘤都缺乏腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原,且某些抗腫瘤T細胞反應需要廣譜的抗原,而不是單一的抗原,因此目前應用較多的還是腫瘤全抗原。Mule5報道體外用負載了腫瘤溶解物的DC作為刺激劑可訓化同系鼠T細胞，導致腫瘤特異性T細胞增殖及細胞因子的產生；在臨床實驗中，負載了黑色素瘤細胞溶解物和匙孔血藍蛋白（KLH）的DC疫苗免疫后產生了KLH特異性T細胞反應，并產生記憶性CTL。Fecci6研究DC疫苗由于治療淋

21、巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，黑色素瘤，白血病和顱內腫瘤有明顯效果。Liau7等人研究報告微酸洗脫腫瘤抗原肽致敏DC治療9L膠質瘤發(fā)現(xiàn)能明顯的增長動物生存期。我們用破碎細胞的方法提取的抗原，盡管該法提取的抗原含有非免疫原性的多肽和細胞內的溶解物，后者可導致自身免疫反應，但從動物實驗并未見明顯的自身免疫反應，比乳酸洗脫法提取抗原方法簡便易行，并能明顯抑制腫瘤生長8，9。本實驗體外大量培養(yǎng)大鼠骨髓來源DC的方法和通過凍融抗原致敏樹突狀細胞制備DC疫苗的方法已建立,實驗證明治療組荷瘤動物的生存時間明顯延長以及治療組腫瘤組織生長明顯抑制，進一步說明DC疫苗的有效性，為深入研究腦膠質瘤臨床免疫治療方案打下基礎。(

22、本文圖13見封2)（略）    【參考文獻】  1 Fresnay S, Chalmers DE. Polybrene and interleukin4: two opposing factors for retroviral transduction of bonemarrowderived dendritic cellsJ.J Gene Med, 2002,4(6):601612.2 Nunez R. Revision of the functional analysis and structural features of immorta

23、lized dendritic cell lines derived form mice lacking both type I and type II interferon receptorsJ. Immunol Lett,1999,68(1):173186.3 Serot JM, Bene MC, Foliguet B,et al. Monocyte derived IL10 secreting dendritic cells in choroids piexus epitheliumJ. J Neuroimmunol, 2000, 105(2): 115119.4 Almand B, Clark JI, Nikitina E, et al. Increased production of imm