非清髓造血干細(xì)胞移植后致敏供者淋巴細(xì)胞輸注對嵌合狀態(tài)及GVH

1、非清髓造血干細(xì)胞移植后致敏供者淋巴細(xì)胞輸注對嵌合狀態(tài)及GVHD影響的實驗研究                作者：陳寶安，張琰，丁家華，畢延智，趙剛，高沖，孫耘玉，孫雪梅，王駿，陳寧娜，程堅【摘要】  本研究目的是探討經(jīng)受者皮膚致敏后的異基因供者淋巴細(xì)胞輸注（DLI）是否能在促進(jìn)形成完全供者嵌合（CC）的同時減輕移植物抗宿主?。℅VHD）。以C57BL/6小鼠（H-2b，B6）為受者，于第0天接受60Co 線全身照射（TBI），總劑量為

2、5.5 Gy，照射當(dāng)天移植經(jīng)粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）動員后的BALB/c小鼠（H-2d，BA）外周血干細(xì)胞（2×107個），移植后第2天腹腔注射環(huán)磷酰胺200 mg/kg，并分別于移植后第28天輸注致敏/未致敏的供者淋巴細(xì)胞2×106。結(jié)果顯示，致敏后DLI的受鼠（黑色）無1例出現(xiàn)GVHD，60天時轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆┱咔逗?，表型明顯呈現(xiàn)為供鼠（白色）特征，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值在DLI后早期下降，半月后有所升高，但仍低于正常水平；未致敏的DLI受鼠出現(xiàn)不同程度的GVHD，嵌合率稍有上升，仍表現(xiàn)為混合嵌合體（MC），CD4+/CD8+比值在DLI后早期升高，后期降

3、至正常水平。結(jié)論：經(jīng)受者皮膚致敏后的DLI在誘導(dǎo)CC的同時降低GVHD發(fā)病率，CD4+/CD8+比值與GVHD發(fā)病率間具有良好的相關(guān)性。 【關(guān)鍵詞】  非清髓性異基因造血干細(xì)胞移植Effects of Sensitized Donor Lymphocyte Infusion on the Chimerism and Graft-versus-Host Disease after Nonmyeloablative Allogeneic Stem Cell TransplantationAbstract    To explore whether the c

4、omplete donor chimerism could be achieved and graft-versus-host disease could be alleviated by  donor lymphocyte  infusion    which was sensitized by the skin of the recipient，female C57BL/6 mice (H-2b，B6) as recipients received total body irradiation (TBI) of 5.5 Gy (60Co -

5、ray) on day 0 followed by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). The allo-grafts consisted of 2×107 peripheral hematopoietic stem cells from mobilized male BALB/c  (H-2d) donor mice with the granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF). Day 2  after allo-HSCT

6、，the recipient mice were given 200 mg/kg cyclophosphamide intraperitoneally. Afterwards these recipient mice were infused 2×106 sensitized or unsensitized-donor lymphocytes at the  28 days after transplantation. The results showed that the mice receiving sensitized-donor lymphocyte infusio

7、n did not suffer from GVHD and the phenotypic character of the recipient mice (black color) converted to that of the donor mice (white color)，and to become full-donor chimerism. It was found that the ratio 0f CD4+/CD8+ T lymphocytes of them decreased at the earlier period and increased after half mo

8、nth，but which were also lower than that of the normal value. While various grades of acute GVHD was observed in that of the control group and the mixed-chimeras were maintained，though it increased a little，and the ratio of CD4+/CD8+ T lymphocytes increased at first，then decreased to the normal level

9、 half month later. It is concluded that  sensitized DLI converted mixed to comlete donor chimerism without GVHD，and the rate of CD4+/CD8+ has close relation to the incidence of GVHD.Key words    nonmyeloablative allogeneic hematopoietic stem cell transplantation；donor lymphocyte

10、infusion；chimerism；graft-versus-host diseaseJ Exp Hematol 2006；14(1):102-106    異基因外周造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是治療惡性血液病的重要手段，特別是近年來隨著非清髓性SCT的開展，給更多的血液病患者帶來了希望。非清髓性移植以較低強(qiáng)度的預(yù)處理誘導(dǎo)受者的免疫耐受，使得供者細(xì)胞植入并形成混合嵌合體，減少了移植相關(guān)并發(fā)癥和相關(guān)死亡。由于混合嵌合體的移植物抗白血病(GVL)作用較弱1，2，且隨著嵌合率的逐漸下降，移植后復(fù)發(fā)率明顯增高，故在其基礎(chǔ)上進(jìn)行供者淋巴細(xì)胞輸注(DLI)，對加強(qiáng)

11、GVL效應(yīng)，降低疾病復(fù)發(fā)率，提高無病生存期具有重要臨床意義。GVHD作為DLI后的主要并發(fā)癥，明顯限制了DLI的臨床應(yīng)用，探索一種既避免GVHD而又不損害GVL效應(yīng)的方法成為目前國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點之一。本研究探討C57BL/6小鼠經(jīng)非清髓性異基因外周造血干細(xì)胞移植后，輸注經(jīng)受鼠皮膚致敏后的供者淋巴細(xì)胞對于嵌合狀態(tài)及GVHD發(fā)病率的影響，同時檢測DLI后T細(xì)胞亞群的變化，以評價CD4/CD8比值與GVHD之間的相關(guān)性。材料和方法動物受鼠為清潔級雌性C57BL/6小鼠(H-2b，B6)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，8-10周齡，體重16.7×1.4 g；供鼠為清潔級雄性BALB

12、/c小鼠(H-2d)，由揚州大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院提供，均飼養(yǎng)于東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級動物房內(nèi)，飼料及墊料均經(jīng)輻照消毒，飲用高壓消毒無菌水。試劑及器材  環(huán)磷酰胺（CTX，200毫克/支，上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品），重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF，75微克/支，上海三維生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），單克隆熒光抗體（FITC anti-mouse CD3、CD4、CD8，25微克/支，杭州聯(lián)科公司代理的美國Caltag公司產(chǎn)品），全血樣本DNA抽提試劑盒（晶美公司代理的美國Gentra公司產(chǎn)品），60Co放療機(jī)（中國核動力研究設(shè)計院GWGT80型60Co遠(yuǎn)距離治療機(jī)，南京市第二人民醫(yī)院提

13、供幫助），流式細(xì)胞儀(美國Beckman-coulter公司產(chǎn)品)。供鼠外周血動員及干細(xì)胞懸液的制備BALB/c小鼠于移植前4天起給予250 g/kg G-CSF，皮下注射，每日1次，末次注射2-3小時后在無菌條件下經(jīng)內(nèi)齜靜脈取血，置入含EDTA的抗凝管中，利用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-hypaque液，比重1.077，20)水平離心30分鐘，400×g，提取單個核細(xì)胞，然后用0.01 mmol/L的PBS液漂洗2次后重懸細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至8×107/ml。異基因干細(xì)胞移植受鼠移植前6天開始飲用含紅霉素（250 mg/L）和慶大霉素（320 mg/L）的無菌水，并持續(xù)

14、至移植后2周。移植當(dāng)日將受鼠置于清潔級包裝的塑料盒內(nèi)接受60Co 射線5.5 Gy全身照射(TBI)，劑量率167.68 cGy/min，照射后4小時內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸注供鼠PBMNC 2×107個，移植后第2天予CTX 200 mg/kg腹腔注射。供鼠淋巴細(xì)胞制備移植后第1天起取B6小鼠背部皮膚1 cm×1 cm，埋入供鼠皮內(nèi)，切口局部縫合。每周1次×4周，以致敏供鼠。第28天致敏與未致敏的供鼠分別經(jīng)內(nèi)齜靜脈采血后以Ficoll分離淋巴細(xì)胞（分離方法同干細(xì)胞采集），用0.01 mmol/L的PBS液重懸細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至8×106/ml。操作均在無菌條件下

15、進(jìn)行。實驗分組設(shè)計移植后每3天采血計數(shù)白細(xì)胞、稱量體重，同時觀察小鼠狀態(tài)，排除死亡小鼠，待第21天造血恢復(fù)，體重穩(wěn)步回升后將22只受鼠隨機(jī)分為3組。A組：單純移植組（n=6）；B組：第28天回輸2×106個未致敏供鼠淋巴細(xì)胞（n=8）；C組：第28天回輸2×106個致敏后供鼠淋巴細(xì)胞（n=8）。同時設(shè)預(yù)處理對照組，觀察造血恢復(fù)及表型變化。所有受鼠均未給予GVHD防止措施。GVHD主要觀察指標(biāo)移植后每日觀察小鼠體重、體形、體位、毛發(fā)、腹瀉等，記錄存活期，存活時間超過60天者為長期存活。每3天稱量體重。死亡小鼠取肝臟、脾臟、小腸和爪墊皮膚組織大體形態(tài)觀察后置于10%福爾馬林液中

16、固定保存，集中包埋、切片，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察，判斷GVHD情況。異基因嵌合體的測定于移植后第21、60、90天分別經(jīng)內(nèi)眥靜脈取各組小鼠外周血250 l，EDTA抗凝后，應(yīng)用Genomic DNA Purification試劑盒提取DNA，保存于-20。PCR擴(kuò)增：輸入雌性B6小鼠體內(nèi)的雄性BALB/c小鼠造血干細(xì)胞帶有Y染色體特有的性別決定基因(SRY基因)。SRY引物用DNAStar軟件設(shè)計，由上海生工生物工程公司合成，上游引物序列為5TGGTGTGGTCCCGTGGTGAGAG3，下游引物序列為5GATGGCATGTGGGTTCCTGTCC3，擴(kuò)增產(chǎn)物為296 bp，以BALB/C的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物為參照。PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液5 l，25 mmol/L MgCl2 5 l，dNTPs 1 l，10 molL上游及下游引物各0.5 l，DNA模板2