融合蛋白標(biāo)簽

1、在蛋白質(zhì)功能及結(jié)構(gòu)研究過程中，研究的首要任務(wù)就是利用多種方法獲得純化的具有完整結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能并能夠正確折疊的高度純化蛋白質(zhì)。除了蛋白質(zhì) 的研究，具有特定生物活性的高價(jià)值蛋白質(zhì)的生產(chǎn)也需要對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行純化。因此，科研人員和工業(yè)生產(chǎn)往往大量采用多種多樣的表達(dá)系統(tǒng)來獲得高表達(dá)的蛋 白質(zhì)，對(duì)其純化后進(jìn)行研究或加工，這些表達(dá)系統(tǒng)包括原核表達(dá)系統(tǒng)、 酵母菌表 達(dá)系統(tǒng)、昆蟲動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。如何將系統(tǒng)中表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)與其他蛋白分離， 一直是表達(dá)純化中的一個(gè) 重點(diǎn)。為了克服從復(fù)雜樣品中純化單一蛋白質(zhì)這種困難，科學(xué)家利用生物物質(zhì)， 特別是酶和抗體等蛋白質(zhì)，具有識(shí)別某種特定物質(zhì)并與該物

2、質(zhì)分子特異性結(jié)合的能力，利用生物分子間的這種特異性結(jié)合能力而形成的親和純化技術(shù)。親和標(biāo)簽 純化技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)，特別是重組蛋白的分離純化中。在重組蛋白的親 和純化中，利用基因工程技術(shù)，將經(jīng)過改造優(yōu)化的親和標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白融合表達(dá), 通過一步簡(jiǎn)單快速的親和層析，直接獲得純度較高的重組融合蛋白，已成為重組 蛋白純化的一個(gè)通用方法，具有結(jié)合特異性高、純化步驟簡(jiǎn)便、純化條件溫和、廣泛應(yīng)用于蛋適用性廣泛等優(yōu)點(diǎn)，為蛋白質(zhì)的有效純化提供了一條解決的途徑, 白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究及重組蛋白純化工藝的開發(fā)中。自從20世紀(jì)70年代中期融合標(biāo)簽技術(shù)出現(xiàn)以來，親和標(biāo)簽已成為一種重組蛋白純化十分有效的工具，具有結(jié)合特

3、異性高、純化條件溫和、純化步驟簡(jiǎn)便、 適用性廣泛等顯著優(yōu)勢(shì)。通常，親和標(biāo)簽定義為對(duì)特定的生物或化學(xué)配基具有高 度親和力的一段氨基酸序列。到目前為止，已經(jīng)出現(xiàn)了種類眾多、功能各異、用 途多樣的親和標(biāo)簽，極大地促進(jìn)了對(duì)重組蛋白的有效純化。根據(jù)自身分子量大小的不同，親和標(biāo)簽可以分為兩大類：一類是結(jié)合固定化配基的短肽標(biāo)簽，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tag n等；另一類是識(shí)別小分子配基的蛋白標(biāo)簽，如GST MBP等。短肽標(biāo)簽:His-tag : His標(biāo)簽是目前高通量蛋白純化最普遍使用的親和標(biāo)簽，廣泛用于多 種重組蛋白在各種表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)與純化中。His標(biāo)簽一般為515個(gè)組氨酸,被

4、認(rèn)為是重組蛋白純化的首選標(biāo)簽，具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）位于目標(biāo)蛋白N端的His標(biāo)簽與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制相互兼容，利于蛋白的表達(dá)；（2） His標(biāo)簽幾乎不影響目標(biāo)蛋白的理化性質(zhì)；（3） His標(biāo)簽很小，不會(huì)改變目標(biāo)蛋白的可溶性；（4） His標(biāo)簽在目標(biāo)蛋白結(jié)晶后對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響；（5）采用固定化金屬離子親和層析純化His標(biāo)簽融合蛋白時(shí)，其操作非常簡(jiǎn)便?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，幾乎所有的大型結(jié)構(gòu)基因組研究中心都把純化His標(biāo)簽融合蛋白的固定化金屬離,IMAC作為子親和層析（immobilized metal-ion affinity chromatography主要的蛋白純化方法。然而，并不是所有的蛋白質(zhì)

5、都可以與 His標(biāo)簽融合后，采用固定化金屬離子親和層析分離純化。宿主蛋白中含有半胱氨酸及天然發(fā)生的組氨酸豐富區(qū)域， 在 固定化金屬離子親和層析時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致其他蛋白的非特異性結(jié)合； 目標(biāo)蛋白含有 金屬離子，一般也不采用His標(biāo)簽與固定化金屬離子親和層析。FLAG-tag：除了 His標(biāo)簽外，另一個(gè)廣泛使用的小分子短肽標(biāo)簽是FLAG標(biāo)簽。FLAGS簽是由8個(gè)氨基酸（DYKDDDD組成的一個(gè)短肽，分子量很小，因而不會(huì)遮蓋融合蛋白中其他的蛋白表位與結(jié)構(gòu)域， 也不會(huì)改變?nèi)诤系鞍椎墓δ?、分泌?運(yùn)輸。該標(biāo)簽具有天然的親水特性，很容易定位于融合蛋白的表面，便于利用抗 體檢測(cè)；同時(shí)含有一個(gè)腸激酶切割位點(diǎn)（DD

6、DK，可以利用腸激酶切除標(biāo)簽。FLAG 標(biāo)簽有3個(gè)特異性的單克隆抗體，分別為 M1單抗、M2單抗、M5單抗。FLAG短肽合成成本較高，不適用于大規(guī)模純化，且需要額外步驟除去結(jié)合在層析介質(zhì)上 的短肽。Strep-tagn：與 His-tag、FLAG-tag 相似，Strep-tagn 也是一個(gè)小分子的短肽標(biāo)簽，廣泛用于多種目標(biāo)蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等的表達(dá)與純化中。在自然界中，鏈霉親和素（streptavidin）與生物素（biotin ）之 間存在著非常強(qiáng)烈的非共價(jià)相互作用， 其生物學(xué)上的解離常數(shù)極低；即使生物素 與其他蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合之后，兩者仍可以相互作用?；谶@兩者之間

7、的強(qiáng)烈相互 作用，運(yùn)用一系列蛋白質(zhì)工程手段，通過對(duì)短肽文庫(kù)的篩選，第一個(gè)鏈霉親和素 結(jié)合肽應(yīng)運(yùn)而生，即 Strep-tag，極大地方便了重組蛋白的一步快速親和純化。 然而，Strep-tag與鏈霉親和素結(jié)合時(shí)需要一個(gè)自由的羧基末端，因而該標(biāo)簽只 能位于目標(biāo)蛋白的C端，限制了它的應(yīng)用范圍。在Strep-tag的基礎(chǔ)上，通過對(duì) 合成短肽的篩選，獲得了一個(gè)與其相似、由8個(gè)氨基酸（WSHP QF）組成的鏈霉親和素結(jié)合肽，即 Strep-tag n,可以位于融合蛋白的任意位置，從而彌補(bǔ)了Stre p-tag的不足。同時(shí)，通過對(duì)鏈霉親和素特定氨基酸的定向突變，獲得了與Strep-tag n具有更高親和力的

8、親和介質(zhì)Strep-tactin，在Strep-tag n融合蛋白的親和純化中表現(xiàn)出良好的純化效果，且蛋白質(zhì)產(chǎn)量較高，所需成本適中。Strep-tag n系統(tǒng)的純化條件比較寬泛，在普通緩沖液下就可與strep-Tactin層 析介質(zhì)結(jié)合，使用2.5mmol/L的脫硫生物素就可將Strep-tag n融合蛋白洗脫下 來，螯合劑、去污劑、還原劑 及高達(dá)1mol/L的鹽均可加入到緩沖液中。此外，Stre p-tag n在純化過程中不依賴金屬離子，十分適合含金屬離子蛋白質(zhì)的純化。蛋白標(biāo)簽:GST GST標(biāo)簽由211個(gè)氨基酸組成，大小約為26kDa,是目前廣泛用于重組蛋白 融合表達(dá)與親和純化的一種蛋白標(biāo)

9、簽。 大量的表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源蛋白在大腸桿 菌表達(dá)系統(tǒng)中過量表達(dá)時(shí)，常會(huì)以包涵體的形式形成不溶性的聚合體，大大降低 了可溶性重組蛋白的產(chǎn)量，增加了后續(xù)蛋白分離純化的難度。 然而，在融合GST 標(biāo)簽進(jìn)行原核表達(dá)的過程中發(fā)現(xiàn)，原 本用于親和純化的GST標(biāo)簽?zāi)茉谝欢ǔ潭?上增大融合蛋白的可溶性，使融合蛋白以可溶形式存在于細(xì)胞質(zhì)中， 不僅促進(jìn)了 目標(biāo)蛋白的正確折疊，提高了蛋白產(chǎn)量，而且有助于后續(xù)的蛋白純化。除了增大 融合蛋白的可溶性之外，GST標(biāo)簽還具有高效的翻譯起始、純化條件溫和、親和 樹脂成本相對(duì)低廉等顯著優(yōu)點(diǎn)，成為重組蛋白融合表達(dá)經(jīng)常使用的親和標(biāo)簽。MBP MBP標(biāo)簽由大腸桿菌K12的malE基

10、因編碼的396個(gè)氨基酸組成，大小約為40kDa,是除了 GST標(biāo)簽之外又一個(gè)很好的增大融合蛋白可溶性的蛋白標(biāo)簽。MBP標(biāo)簽?zāi)軌蛟龃笤谠吮磉_(dá)系統(tǒng)中過量表 達(dá)的融合蛋白的可溶性，提高其表達(dá)量， 已在多個(gè)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中得到確認(rèn)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)改變 MBP “開放”與“關(guān)閉”構(gòu)象 之間的平衡時(shí)，MB氏曾大融合蛋白可溶性的能力將受到明顯影響，表明MBP增大 融合蛋白可溶性的特性是由其“開放”構(gòu)象所介導(dǎo)； 同時(shí)，對(duì)MBPS基結(jié)合間隙 中保守的疏水性氨基酸殘基進(jìn)行定向突變， MBPS現(xiàn)出相似的表型，表明這個(gè)配基結(jié)合間隙在MBP增大融合蛋白可溶性的機(jī)制中具有一定的作用。然而，從蛋白純化的角度來看，MB際簽并不是一

11、個(gè)最有效的親和標(biāo)簽；在某些 情況下，MBPS簽并不能特異性地與親和樹脂有效結(jié)合，親和層析后融合蛋白的 純度也并不合適。自從上世紀(jì)70年代中期親和標(biāo)簽融合技術(shù)出現(xiàn)以來，多種多樣的短肽或蛋白親和標(biāo)簽極大地方便了外源表達(dá)重組蛋白的分離與蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化，已成 為蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域不可或缺的工具。 一般而言，一個(gè)完美的親和標(biāo)簽應(yīng)該具備以下特性：（1）能夠用于純 化任何表達(dá)宿主或表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的重組蛋白；（2） 可以位于目標(biāo)蛋白的任意位置而不影響其結(jié)構(gòu)；（3）增大目標(biāo)蛋白的可溶性, 促進(jìn)其正確折疊，提高蛋白表達(dá)量；（4）便于重組蛋白的檢測(cè)。目前，商品化 的親和標(biāo)簽已具備其中諸多特性，但性能更加優(yōu)越、純化效

12、果更加顯著的親和 標(biāo)簽仍需不斷尋找與開發(fā)。重組蛋白表達(dá)技術(shù)現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)具體領(lǐng)域。 特別是體內(nèi)功能 研究和蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)都需要應(yīng)用重組蛋白表達(dá)載體。美國(guó)GeneCopoeia的蛋白表達(dá)載體按照表達(dá)宿主的不同新推出3類，分別為表達(dá)宿主為大腸桿菌， 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的， 以及慢病毒載體， 宿主可以為哺乳動(dòng)物 細(xì)胞和原代細(xì)胞。除了必要的復(fù)制和篩選的元件， 協(xié)助表達(dá)和翻譯的元件外， 本文將各類載體 分別按照功能標(biāo)簽的不同確定種類并將個(gè)標(biāo)簽的功能初步介紹如下：His6：His6 是指六個(gè)組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽，可插入在目的蛋白的 C 末端或N末端。當(dāng)某一個(gè)標(biāo)簽的使用，一是能構(gòu)成表位利于純化

13、和檢測(cè)；二是構(gòu)成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征（結(jié)合配體）利于純化。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力， 可用于固定化金屬螯合層析（IMAC），對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化。使用 His-tag 有下面優(yōu)點(diǎn)：1. 標(biāo)簽的分子量小，只有0.84KD,而GST和蛋白A分別為26KD和30KD一般不影響目標(biāo)蛋白的功能;2. His 標(biāo)簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件 下純化，前者在純化疏水性強(qiáng)的蛋白得到應(yīng)用， 后者在純化包涵體蛋白時(shí)特別有 用，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白， 使復(fù)性不受其 它蛋白的干擾，或進(jìn)行金屬螯和親和層析復(fù)性；3. His標(biāo)簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-

14、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究;4. His 標(biāo)簽免疫原性相對(duì)較低， 可將純化的蛋白直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫制備 抗體;5. 可應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)，純化的條件溫和;6. 可以和其它的親和標(biāo)簽一起構(gòu)建雙親和標(biāo)簽。Flag:Flag 標(biāo)簽蛋白為編碼 8 個(gè)氨基酸的親水性多肽（ DYKDDDD），K 同時(shí)載體中構(gòu) 建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。FLAG作為標(biāo)簽蛋白，其融合表達(dá)目的蛋白后具有以下優(yōu)點(diǎn):1. FLAG 作為融合表達(dá)標(biāo)簽，其通常不會(huì)與目的蛋白相互作用并且通常不會(huì)影響目的蛋白的功能、性質(zhì)，這樣就有利用研究人員對(duì)融合蛋白進(jìn)行下游研究。2. 融合FLA

15、G的目的蛋白，可以直接通過FLAG®行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高。3. FLAG作為標(biāo)簽蛋白，其可以被抗FLAG的抗體識(shí)別，這樣就方便通過Western Blot、ELISA等方法對(duì)含有FLAG的融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)、鑒定。4.融合在N端的FLAG其可以被腸激酶切除（DDDK,從而得到特異的目的蛋白。因此現(xiàn)FLAG標(biāo)簽已廣泛的應(yīng)用于蛋白表達(dá)、純化、鑒定、功能研究及其 蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域。MBP:MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽蛋白大小為 40kDa,由大腸桿菌K12的malE基 因編碼。MBP可增加在細(xì)菌中過量表達(dá)的融合蛋白的溶解性，尤其是真核

16、蛋白。MBP標(biāo)簽可通過免疫分析很方便地檢測(cè)。有必要用位點(diǎn)專一的蛋白酶切割標(biāo)簽。如果蛋白在細(xì)菌中表達(dá)，MBF可以融合在蛋白的N端或C端。純化：融合蛋白可通過交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。結(jié)合的融合蛋白可用10m M麥芽糖在生理緩沖液中進(jìn)行洗脫。結(jié)合親和力在微摩爾范圍。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100 或0.25% Tween 20存在下不能有效結(jié)合，而其他融合蛋白則不受影響。 緩沖條件為PH7.0到8.5，鹽濃度可高達(dá)1M,但不能使用變 性劑。如果要去除MBF融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。檢測(cè)：可用MBP抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè)。GST:GST谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽

17、蛋白本身是一個(gè)在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為 26KD將它應(yīng)用在原核表達(dá)的原因大致有兩個(gè)， 一個(gè)是因?yàn)樗且粋€(gè)高度可溶的蛋白， 希 望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個(gè)是它可以在大腸桿菌中大量表達(dá)， 起到提高表達(dá)量的作用。GST®合表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于各種融合蛋白的表達(dá)，可 以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用10mM還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數(shù)情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的,并形成二體。GST標(biāo)簽可用酶學(xué)分析或免疫分析很方便的檢測(cè)。標(biāo)簽有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。在大多數(shù)情況下GST融合蛋白是完全或部

18、分可溶的。純化：該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GST標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathionesepharose)親和樹脂進(jìn)行純化。GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會(huì)失去對(duì)谷胱甘肽樹脂的結(jié)合能力， 因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng) 變性劑如：鹽酸胍或尿素等。如果要去除GST融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。檢測(cè)：可用GST抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè)。HAHA標(biāo)簽蛋白，標(biāo)簽序列YPYDVPDYAM于流感病毒的紅細(xì)胞凝集素表面抗原 決定簇， 9 個(gè)氨基酸，對(duì)外源靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響小 , 容易構(gòu)建成標(biāo)簽

19、蛋白融 合到N端或者C端。易于用Anti HA抗體檢測(cè)和ELISA檢測(cè)。c-MycC-Myc 標(biāo)簽蛋白，是一個(gè)含Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu質(zhì)框架中仍可識(shí)別其相應(yīng)抗體。11 個(gè)氨基酸的小標(biāo)簽，標(biāo)簽序列 Glu-Gln-Lys-，這 11 個(gè)氨基酸作為抗原表位表達(dá)在不同的蛋白C-Myc tag 已成功應(yīng)用在 Western-blot 雜交技 術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)中 , 可用于檢測(cè)重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的表達(dá)。eGFP/eCFP/eYFP/mCherry分別是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 / 增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋白 / 增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋 白/單體紅色熒光蛋白 ,具有不同的激發(fā)

20、波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)為， 均由野生型熒光蛋白通過氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來。 就eGFP而言，相對(duì)于GFP其熒光強(qiáng)度更強(qiáng)、熒光性質(zhì)更穩(wěn)定。同時(shí)載體中構(gòu)建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。mCherry是從DsRed演化來的性能最好的一個(gè)單體 紅色熒光蛋白，可以和GFP系列熒光蛋白共用，實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)表明, mCherry在N端和C端融合外源蛋白時(shí)，熒光蛋白活性和被融合的目標(biāo)蛋白功能相互沒有明顯影響。 這些熒光標(biāo)簽蛋白， 其融合表達(dá)目的蛋白后具有以下優(yōu)點(diǎn)：1. 不用破碎組織細(xì)胞和不加任何底物， 直接通過熒光顯微鏡就能在活細(xì)胞中 發(fā)出綠色熒光， 實(shí)時(shí)顯示目的

21、基因的表達(dá)情況， 而且熒光性質(zhì)穩(wěn)定， 被譽(yù)為活細(xì) 胞探針。2. 其自發(fā)熒光，不需用目的基因的抗體或原位雜交技術(shù)就可推知目的基因在細(xì)胞中的定位等情況。3. 同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的其它產(chǎn)物不會(huì)干擾標(biāo)簽蛋白檢測(cè)， 從而使其檢測(cè)更顯得快速、 簡(jiǎn)便、靈敏度高而且重現(xiàn)性。4. 其低消耗、高靈敏度檢測(cè)，十分適用于高通量的藥物篩選。因此現(xiàn) eGFP表達(dá)標(biāo)簽被廣泛地應(yīng)用于基團(tuán)表達(dá)調(diào)控、 轉(zhuǎn)基因功能研究、 蛋白在細(xì)胞中的功能 定位、遷移變化及藥物篩選等方面。5.mCherry 紅色熒光蛋白在標(biāo)記病毒顆粒， 研究病毒和宿主細(xì)胞之間更有得 天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。如用 mRFP或mCherry標(biāo)記HIV病毒顆粒，研究H1V和宿主細(xì)胞問的

22、相互作用以及HIV侵染宿主細(xì)胞的過程.用 mRFP標(biāo)記慢病毒顆粒，研究慢 病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制過程等。熒光素酶來源于生物體內(nèi)的熒光素，常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia 熒光素酶。這些熒光素酶作為“報(bào)告蛋白”被用于分子生物學(xué)研究中， 這種技術(shù)被稱為報(bào)告基因檢測(cè)法或螢光素酶檢測(cè)法( Luciferase Assay )。跟普 通融合蛋白標(biāo)簽不同， 使用熒光素酶構(gòu)建的報(bào)告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究啟動(dòng)子、 miRNA3'UTR 克隆的功能與調(diào)控，因?yàn)樗鼈儗?duì)目的基因 的調(diào)控可以是漸變的，而不是簡(jiǎn)單的開和關(guān)兩種狀態(tài)。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，檢測(cè)幅度寬；不是哺乳動(dòng)物細(xì)

23、胞內(nèi)源性基因；重復(fù)性好； 與HTS兼容等。螢火蟲和海腎熒光素酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于協(xié)同報(bào)告并進(jìn)行均一化 研究。由于它們都是快速， 容易和高靈敏的監(jiān)測(cè)方法。 而且螢火蟲和海腎熒光素酶是理想的雙基因報(bào)告系統(tǒng)， 因?yàn)樗鼈儊碓从诓煌纳镞M(jìn)化方向， 蛋白結(jié)構(gòu)和底物差異都很大，在實(shí)驗(yàn)中不會(huì)產(chǎn)生相互影響?；跓晒馑孛傅奶匦?，我司研發(fā)提供的 Secrete-Pair? Dual LuminescenceAssay Kit可用于分析雙報(bào)告系統(tǒng)中 Gaussia熒光素酶(GLuC和分泌型堿性磷 酸酶(SEAP)活性。GLuc和SEAP勻?yàn)榉置谛蛨?bào)告蛋白，無需裂解細(xì)胞即可便捷的 從細(xì)胞培養(yǎng)液中取得樣本，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)

24、行精準(zhǔn)的實(shí)時(shí)分析。Avi TagAviTag 標(biāo)簽蛋白是一個(gè) 15 個(gè)氨基酸的短肽， 具有一個(gè)單生物素化賴氨酸位點(diǎn)，與已知天然可生物素化序列完全不同， 可以加在目標(biāo)蛋白的N端和C端。融 合表達(dá)后， 可被生物素連接酶生物素化， 為了純化重組蛋白選用低親和性的單體 抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物， 除了用于蛋白質(zhì)分離純化， 還用于蛋白質(zhì) 相互作用研究。Avi Tag 標(biāo)簽系統(tǒng)具有以下幾大優(yōu)點(diǎn) :1.無論在體外或者體內(nèi)，幾乎所有的蛋白都可以在一個(gè)獨(dú)特的 Avi Tag位點(diǎn) 輕易且有效地被生物素化；2. 生物素化是通過酶和底物的反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)， 反應(yīng)條件相當(dāng)溫和而且標(biāo)記的專 一性極高；3. 生物素 Av

25、iTag 只有 15個(gè)氨基酸，對(duì)蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響非常小。SNAP-TagSNA P-Tag是新一代的蛋白標(biāo)簽技術(shù)，不僅專一性極高而且穩(wěn)定，最大的優(yōu) 點(diǎn)是適用于多種環(huán)境下的蛋白質(zhì)檢測(cè)與純化，如活細(xì)胞內(nèi)、溶液中、或固態(tài)相 （如SDS-P AGE gels）等。SNAP-Tag是從人的06-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移（06-alkylguanine-DNA- alkyltransferase ）獲得。無論體內(nèi)還是體外，SNAP-Tag都能與底物高特異性地共價(jià)結(jié)合，使蛋白標(biāo)記上生物素或熒光基團(tuán)（如熒光素和若丹明）。SNAP所帶的活性巰基位點(diǎn)接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側(cè)鏈苯甲基基團(tuán)，釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價(jià)結(jié)合使 SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團(tuán)所帶的標(biāo)記物。苯甲基鳥嘌呤在生化條件下穩(wěn)定，并且沒有其他蛋白會(huì)和這類物質(zhì)作用，所以SNAP標(biāo)簽反應(yīng)是高特異的。檢測(cè)：生物素或各種顏色熒光的底物 （如熒光素、若丹明）可滲透進(jìn)入細(xì)胞，SNAP-方便快捷地進(jìn)行