動物組織RNA提取及熒光定量PCR精講

1、RNA提取及提取及Q-PCR相關技術相關技術主講：宋志新利用含有變性劑和Rnase抑制劑的有機溶劑提取RNA，是目前常用的RNA提取方法。Trizol（主要成分為異硫氰酸胍和酚），具有極強的裂解能力，可在短時間內裂解細胞和組織樣本，保持樣品中RNA的完整性，有效抑制RNA的降解。樣品在Total RNA Extraction Reagent中能夠充分被裂解，在加入氯仿離心后，溶液會形成上清層、中間層和有機層 (鮮紅色下層)，RNA分布在上層水相中，收集上清層后，經異丙醇沉淀便可以回收得到Total RNA。提取的總RNA純度高，基本不含蛋白質及基因組DNA，提取的RNA可直接用于Norther

2、n，點雜交，mRNA純化，體外翻譯，RT-PCR，以及構建cDNA文庫等各種分子生物學實驗。Total RNA Extraction Reagent廣泛適用于培養(yǎng)細胞、動物組織、微生物等。下面介紹動物組織Total RNA的提取方法RNA提取RNA提取RT-PCRQ-PCR注意事項總結概要RNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取實驗材料實驗材料1、組織（以小鼠肝臟為例）2、RNAiso Plus（Code No: 9108）（作用同TRIzol）3、其他：氯仿、異丙醇、75%乙醇、研缽、加樣器、1.5ml EP管、槍頭等。（均為RNase-free）0.1%DEPC水有毒RN

3、A提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取準備工作準備工作戴口罩、手套、帽子提取區(qū)域：用75%乙醇擦拭試驗臺試驗器具：用75%乙醇擦拭加樣槍 準備RNase-free的槍頭和離心管 低溫離心機預冷至4 準備-20預冷的75%乙醇RNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取RNA的提取步驟的提取步驟1、從小鼠體內取出肝臟，用預冷的生理鹽水清洗。2、使用液氮迅速冷凍組織， -80冰箱保存。3、使用液氮充分預冷研缽。4、將稱重冷凍的組織（約50-100mg）從冰箱取出后迅速放入預冷好的研缽中，用研杵研磨組織，期間不斷加入液氮，直至組織被研磨成粉末狀。（注：無明顯的可見顆粒，

4、如果研磨不徹底會影響RNA的收率和質量。）RNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取RNA的提取步驟的提取步驟5、向研磨成粉末狀的樣品中加入1ml RNAiso Plus，并完全覆蓋樣品。（注：在加入RNAiso Plus時要保證組織沒有融化，否則RNA易被RNase降解。）6、室溫靜置510 min。7、待樣品融化后，用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。將勻漿液轉移至1.5ml EP管中，室溫靜置5 min后，4，13000rpm離心5 min，將上清轉移至新的1.5ml EP管中。RNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取RNA的提取步驟的提取步驟8、每1ml液

5、體中加入1/5體積（約200l）的氯仿，蓋緊EP管，用手劇烈震蕩15秒，直至溶液充分乳化，無分相現(xiàn)象。（注：不能用振蕩器混勻，因為容易造成DNA和RNA的物理降解。）9、室溫靜置5 min，4，13000rpm離心15 min。10、從離心機中小心取出EP管，此時勻漿液分為三層，上層是透明的水層，RNA溶解在此層中；半固體狀的中間層，此層中包含DNA；下層為粉紅色的有機溶劑，蛋白質、多糖等物質溶解在此層中。RNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取RNA的提取步驟的提取步驟11、將上層水相溶液小心轉移至新的EP管中，大約每個EP管中能取出400500l，謹慎操作，切勿吸到中間層

6、。（注：下層有機廢液勿亂丟，收集起來統(tǒng)一進行無毒化處理。）12、加入等體積異丙醇，上下顛倒EP管，充分混勻。13、室溫靜置10 min后，4，13000rpm離心10 min?？稍陔x心后的EP管底部觀察到少量的白色沉淀。RNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取RNA的提取步驟的提取步驟14、小心棄去上清。15、向含有沉淀的EP管中緩緩加入1ml預冷75%乙醇，輕輕上下顛倒，清洗沉淀。（動作輕柔，無需將沉淀懸浮起來）16、4，13000rpm離心5 min。用移液器除去上清。17、將EP管瞬時離心，用移液器仔細將殘存在EP管底部的少量液體除去。RNA提取概要RT-PCRQ-PC

7、R注意事項總結RNA提取RNA的提取步驟的提取步驟18、打開EP管，室溫放置干燥（目的是讓殘留的乙醇揮發(fā)，乙醇的殘留可能對后續(xù)的反應有影響）。干燥的時間不宜太久，RNA完全干燥后很難溶解19、用RNase-free ddH2O溶解沉淀。（視RNA量的多少所加RNase-free ddH2O的體積從20-200不等，肝臟組織RNA產率較高，肺組織產率低）20、RNA溶液保存在-80冰箱中。RNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取RNA的濃度及質量檢測的濃度及質量檢測1、濃度及純度檢測：（Thermo SCIENTIFIC NANODROP 1000 Spectrometer ）

8、核酸在260nm附近有強吸收，蛋白質在280nm附近有強吸收。所以測定溶液在260nm和280nm下的吸光度，根據A260計算提取的核酸量，根據A260/A280的比值評價提取的核酸純度。理想的RNA純度A260/A280應在1.82.2范圍內。低 離 子 強 度 或 低 p H 值 會 使 O D 2 8 0 升 高 ， 從 而 使OD260/OD280值低（1.65）RNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取RNA的濃度及質量檢測的濃度及質量檢測2、質量檢測凝膠電泳法利用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，如果可以清晰觀察到兩條rRNA條帶（真核生物：28S和18S；原核生物：23S

9、和16S），且其濃度比值大約為2:1，則RNA未降解。若觀察到smear現(xiàn)象，或比值小于2:1，則RNA已發(fā)生降解。如果觀察到大于28S或23S的條帶，則樣品可能有基因組DNA污染，這時可以考慮使用DNase I處理。若有條帶，可能混入了基因組DNA28S rRNA18S rRNAtRNA等DL2000 DNA Marker電泳圖（1%瓊脂糖膠，TAE）RNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取RNA的濃度及質量檢測的濃度及質量檢測2、質量檢測凝膠電泳法實驗材料： a. 提取的RNA溶液 b. DL2000 DNA Marker c. 6Loading Buffer d. 1%

10、的瓊脂糖凝膠（加1l Goldview/20ml凝膠） e. 1TAE Buffer f. 電泳儀 g. UV凝膠成像儀RNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取RNA的濃度及質量檢測的濃度及質量檢測2、質量檢測凝膠電泳法實驗操作：1）取10l RNA原液至一個1.5ml EP管中，使用RNase-free ddH2O將其稀釋至200ng/l。注：需RNase-free ddH2O體積(l)=10lRNA濃度(ng/l) /200(ng/l)-10l2）取5l RNA（200 ng/l）至一個小 EP管中，以供電泳使用。（注：剩余部分于-80保存?zhèn)銻T反應用）3）將上步的RNA

11、 70加熱2 min。4）冰上冷卻。RNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取RNA的濃度及質量檢測的濃度及質量檢測2、質量檢測凝膠電泳法實驗操作：5）向每管中加入1l 6Loading Buffer，混合均勻。 6）將瓊脂糖凝膠放入到電泳槽中。7）導入1TAE Buffer，完全浸過膠面。8）點樣：將管內樣品全部加入到一個凝膠孔里。9）電泳：100-120V，約20-30分鐘。10）凝膠成像。RNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取RNA產率估計產率估計部分組織的RNA產率估計組織材料樣品量Total RNA收率肝1g約5000g腦1g約1500g腎1g約3

12、000g骨骼肌1g約1500gHL-601107細胞約100g白細胞1107細胞約20-40gRNA提取概要RT-PCRQ-PCR注意事項總結RNA提取RNA降解巨噬細胞RNA巨噬細胞RNA動物組織RNA逆轉錄PCR（RT-PCR）概要RNA提取RT-PCR注意事項總結Q-PCR反轉錄（反轉錄（RT）反應）反應RNA自身不能作為PCR反應的模板，所以必須先將其反轉錄為cDNA。實驗操作：1）將提取的RNA調整濃度為500ng/l，并于70變性2min。2）配反應體系（注意：不同的試劑盒體系不同，我們用的是TaKaRa的RR037A） 20l體系 5x Buffer 4l Oligo dT Pr

13、imer 1l Random 6 mers 1l DEPC H2O 1l Enzymermix 1l 提取的RNA模板 2l逆轉錄PCR（RT-PCR）概要RNA提取RT-PCR注意事項總結Q-PCR反轉錄（反轉錄（RT）反應）反應實驗操作：1）RT-PCR程序：37, 15min 85, 5s 4, 反轉錄過程使反轉錄酶失活得到的cDNA短期可在4保存數(shù)天，長期保存應在-20以下熒光定量PCR（Q-PCR）概要RNA提取RT-PCRQ-PCR注意事項總結在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時在線監(jiān)測整個反應進程，并結合相應的軟件對未知模板進行定量分析的方法。熒光定量PCR（Q-

14、PCR）概要RNA提取RT-PCRQ-PCR注意事項總結熒光定量PCR（Q-PCR）概要RNA提取RT-PCRQ-PCR注意事項總結熒光定量PCR（Q-PCR）概要RNA提取RT-PCRQ-PCR注意事項總結QPCR雙標記探針（雙標記探針（Taqman Probe）熒光報告基團（Reporter）熒光淬滅基團（Quencher）序列特異性寡核苷酸探針53 游離狀態(tài)下，F(xiàn)RET效應，不發(fā)熒光 伴隨產物生成，熒光積累RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation雙標記探針（雙標記探針（Taqman Probe）熒光定量PCR（Q-PCR）概要RNA提取RT-PCRQ-P

15、CR注意事項總結QPCR注意事項總結概要RNA提取RT-PCRQ-PCR注意事項總結常見問題及疑難解答常見問題及疑難解答提取RNA收率低當收率明顯低于預期時，可以考慮以下原因：1）加入Trizol或RNAiso Plus后樣品勻漿不充分；2）分層時水相回收率低；3）RNA沉降后與水復溶性不好；4）異丙醇沉降或洗滌過程中混入Rnase。注意事項總結概要RNA提取RT-PCRQ-PCR注意事項總結常見問題及疑難解答常見問題及疑難解答提取的RNA難以溶解1）75%乙醇清洗沉淀后不要干燥時間過長或加熱干燥；2）若難溶可以于60加熱5分鐘后再于冰上溶解數(shù)小時。注意事項總結概要RNA提取RT-PCRQ-PCR注意事項總結常見問題及疑難解答常見問題及疑難解答提取的RNA降解1）提取RNA