ELISA試驗(yàn)質(zhì)量控制問(wèn)題資料

1、ELISA實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制問(wèn)題1.1 基本概念1.1.1 質(zhì)量控制（QuailityControl,Q.C）質(zhì)量控制是監(jiān)視全過(guò)程，排除誤差，防止變化，維持標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀的一個(gè)管理過(guò)程。這一過(guò)程是通過(guò)一個(gè)反饋環(huán)路進(jìn)行的。1）確定控制的對(duì)象；2）規(guī)定控制對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)（預(yù)期值）；3）制定或選擇控制方法和手段；3）測(cè)量實(shí)際數(shù)據(jù)；4）比較或較對(duì)實(shí)際數(shù)據(jù)與預(yù)期值之間的差異，并說(shuō)明產(chǎn)生這一差異的原因。超出預(yù)定誤差范圍，報(bào)警系發(fā)出信號(hào)，反饋通道中斷。5）采取行動(dòng)，解決差異?；謴?fù)原狀（原標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)）的手段發(fā)揮作用。質(zhì)量控制主要采用質(zhì)控圖進(jìn)行。質(zhì)控圖是把某一檢驗(yàn)的性能數(shù)據(jù)與所計(jì)算出來(lái)的預(yù)期的控制限”進(jìn)行比較的圖。這種性能數(shù)據(jù)

2、是在按規(guī)程正常進(jìn)行時(shí)，按時(shí)間順序而抽選出來(lái)的，其目的是檢測(cè)檢驗(yàn)過(guò)程中變異的可追查性原因?？勺纺嫘缘恼`差原因，是指除去隨機(jī)誤差以外的其他原因。控制限”是通過(guò)統(tǒng)計(jì)計(jì)算出來(lái)的，在后我們將詳細(xì)介紹（見(jiàn) 1.3.室內(nèi)質(zhì)控程序）。1.1.2 誤差實(shí)驗(yàn)誤差分為三種：系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差和過(guò)失誤差。系統(tǒng)誤差是指一系列測(cè)定結(jié)果與真值或靶值存在有同一傾向的誤差，有明顯的規(guī)律性，可在一定條件下重復(fù)出現(xiàn)，是可以通過(guò)質(zhì)控預(yù)防和校正的。隨機(jī)誤差又稱偶然誤差，是一種偶然的、未能預(yù)料到的誤差，是難以避免和校正的誤差。檢驗(yàn)工作中隨機(jī)誤差的分布符合正態(tài)分布規(guī)律。過(guò)失誤差是人為的責(zé)任誤差。通過(guò)加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室管理和開(kāi)展質(zhì)量控制工作是可以避

3、免的。1.1.3 正態(tài)分布及標(biāo)準(zhǔn)差ELISA 試驗(yàn)中，檢驗(yàn)同一樣本達(dá) 20 次以上時(shí)，就會(huì)發(fā)現(xiàn)這組數(shù)據(jù)（指測(cè)定結(jié)果的吸光值）分布在均值兩側(cè)，大部分集中在均值附近。如果以測(cè)定值為橫坐標(biāo)，以出現(xiàn)的頻率為縱坐標(biāo)作圖，就可繪出一個(gè)呈鐘形的曲線圖。如圖 5-1,鐘頂處為均值，其他值以均值為中心對(duì)稱分布，這就是正態(tài)分布。換言之，當(dāng) ELSIA 檢測(cè)同一樣本達(dá)一定次數(shù)后所得的一組數(shù)據(jù)，其中靠近均值（X）的土 SD 范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)，占該組數(shù)據(jù)的 68%,在 X 土 2SD范圍內(nèi)分布的數(shù)據(jù)占總體的 95%,在 X 土 3SD 范圍內(nèi)分布的數(shù)據(jù)占總體的 99%。當(dāng)我們要求檢驗(yàn)結(jié)果在X2SD 范圍內(nèi)為合格時(shí)，將有 9

4、5%的數(shù)據(jù)可能合格。2.1真值用確切的、最理想的決定性方法測(cè)得的值，稱為真值。真值一般是測(cè)不到的。通過(guò)可靠的決定性方法測(cè)出的值，稱為靶值，通常用靶值來(lái)表示真值的大小。2.1準(zhǔn)確度（accuracy）是指測(cè)定結(jié)果與真值（或靶值）接近的程度。準(zhǔn)確度不能以數(shù)字表示，往往用不準(zhǔn)確度來(lái)衡量。測(cè)定結(jié)果與靶值的偏離程度稱為偏差，它表示該項(xiàng)檢驗(yàn)的不準(zhǔn)確度。絕對(duì)偏差=檢驗(yàn)的均值-真值（或靶值）相對(duì)偏差=絕對(duì)偏差真值+（或靶值）X100%2.1精密度（Precision）是指對(duì)同一樣本重復(fù)測(cè)定時(shí)，每次測(cè)定結(jié)果與平均值的接近程度，即重復(fù)測(cè)定值之間的符合程度。2.1標(biāo)準(zhǔn)品1、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品由 WHO 或相應(yīng)組織標(biāo)定的，用

5、肯定的、公認(rèn)的、準(zhǔn)確的物理或化學(xué)方法測(cè)定的定值材料。2、國(guó)際生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)生物學(xué)反應(yīng)由 WHO 或相應(yīng)組織標(biāo)定的國(guó)際活性單位的材料。3、參考標(biāo)準(zhǔn)血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化組織根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的法定材料?？捎糜阼b定儀器和鑒定方法準(zhǔn)確性。2.1臨床決定性水平（clinicaldecisionleuel）當(dāng)某個(gè)被測(cè)物的濃度達(dá)到某一水平時(shí)，臨床醫(yī)師必須采用醫(yī)療措施。為臨床決定性水平。2質(zhì)量控制血清質(zhì)控血清是已有靶值的血清，在每次的常規(guī)檢驗(yàn)中加入一份或數(shù)份，解本次檢驗(yàn)的情況。質(zhì)控血清檢驗(yàn)的結(jié)果如能控制其誤差在一定范圍內(nèi)，發(fā)生不允許的誤差。如果出現(xiàn)超過(guò)允許誤差范圍的異常結(jié)果，提示該檢驗(yàn)不合格，應(yīng)尋找原因，糾正

6、后，重檢待測(cè)標(biāo)本。因此質(zhì)控血清在質(zhì)控工作中起重要作用。質(zhì)控血清的使用衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心制備的乙肝標(biāo)志物質(zhì)控血清，可以在-20C 保持半年定值不變。冰凍狀態(tài)融化使用時(shí)，應(yīng)先混勻，未用完部分可在 4c 保存 5 天。不宜反復(fù)冰融或自行分裝。開(kāi)展某項(xiàng)檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控工作需要的質(zhì)控血清，一般按 3-6 個(gè)月用量準(zhǔn)備。自制的不定值質(zhì)控血清，在一批質(zhì)控血清將用完之前，需準(zhǔn)備下一批質(zhì)控血清。質(zhì)控血清要求性能穩(wěn)定，較長(zhǎng)期內(nèi)效價(jià)不變，其理化性質(zhì)應(yīng)與病人樣本相近，這樣才能有效地起到監(jiān)測(cè)作用。臨界值質(zhì)控血清質(zhì)控制血清分定值和未定值兩種。如只用一份質(zhì)控血清定值，一般定在正常值與異常值交界點(diǎn)上，定性測(cè)定時(shí)處于弱陽(yáng)性水平，

7、稱為臨界值。乙肝標(biāo)志物臨界值的制定，應(yīng)按臨床要求，為臨床提供統(tǒng)一的判斷弱陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)。臨界值質(zhì)控血清可以作為試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品以外的第三個(gè)對(duì)照品，它可以靈敏地反映出試劑盒的檢出水平，確保弱陽(yáng)性反應(yīng)的標(biāo)本不漏檢。質(zhì)控血清的制備每個(gè)實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自己的條件，選用臨床中心提供的質(zhì)控血清，或按以下方法自己制備本室使用的質(zhì)控血清（以乙肝質(zhì)控血清為例）。1）收集新鮮的無(wú)溶血、無(wú)黃疸、無(wú)細(xì)菌污染的陽(yáng)性血清。56c 加熱 10 小時(shí)來(lái)活。離心或過(guò)濾除去沉淀。4）用 10%的小牛血清或正常人血清（PBS 緩沖液）將收集的血清稀釋至所需的濃度。如能用正常的人血清稀釋更好，因其成份更接近于檢測(cè)標(biāo)本。5）

8、抽濾除菌。按一次使用的量分裝小安甑，封口，20c 保存?zhèn)溆?。不可反?fù)凍融。被檢物要求檢出的水平常被認(rèn)為是質(zhì)控血清應(yīng)選擇的水平。如果該試驗(yàn)還有其它要求，則應(yīng)加所要求濃度的質(zhì)控物。6）標(biāo)定含量。20-30 次測(cè)定結(jié)果刪除i2SD 數(shù)據(jù)的均值作為靶值，并與已知定值血清對(duì)比測(cè)定。1.3 室內(nèi)質(zhì)量控制程序臨床檢驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，每次或每天之間不可能沒(méi)有誤差。決定允許的誤差范圍，以臨床上不造成誤診與漏診為準(zhǔn)，通過(guò)以下步驟來(lái)確定質(zhì)控范圍。1）最佳條件下的測(cè)定誤差。2）已知值的血清在常規(guī)檢驗(yàn)條件下的誤差。3）未知值的血清在常規(guī)檢驗(yàn)條件下的誤差。被測(cè)物的這濃度稱通過(guò)所得結(jié)果來(lái)了就說(shuō)明該檢驗(yàn)沒(méi)有4）臨床應(yīng)用的要求。對(duì)

9、任何一個(gè)試驗(yàn)都應(yīng)確定一個(gè)允許的誤差范圍，前題是滿足臨床要求。如允許誤差定得過(guò)小，在臨床上不存在任何意義，但為了符合該規(guī)定卻要花費(fèi)很大人力、物力和時(shí)間。相反，如果將允許誤差定得過(guò)大，將使監(jiān)測(cè)系統(tǒng)察覺(jué)不到臨床上要求檢出的誤差，失去質(zhì)控的意義。最佳條件下已知值質(zhì)控血清變異（optimalconditionsvariance,簡(jiǎn)稱 OCV）的測(cè)定在本實(shí)驗(yàn)室最佳條件下（包括操作者、試劑、儀器等）檢測(cè)質(zhì)控血清 20-30 次，測(cè)得結(jié)果計(jì)算，求出該組數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示該實(shí)驗(yàn)室的最佳工作質(zhì)量?，F(xiàn)舉例說(shuō)明 HBsAgELISA 法檢測(cè)時(shí) OCV 的測(cè)定。使用的質(zhì)控制血清為臨界血清，HBsAg 濃度為

10、 5ng/ml。在該實(shí)驗(yàn)室中選擇素質(zhì)最好、操作最熟練的技術(shù)員進(jìn)行認(rèn)真地專門測(cè)定，選用最佳的試劑盒，檢測(cè)之前，將恒箱、加樣器等認(rèn)真校正、調(diào)校正、調(diào)試，使用新的加樣吸頭等，即在最佳、最理想的條件下進(jìn)行檢測(cè)。除質(zhì)控血清外同時(shí)測(cè)定陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品。并作雙份測(cè)定，得出 2 個(gè)吸光值（A 值），求出 X。連續(xù)作 20 次，求出 20 個(gè)X,即 X1X20o 從這 20 個(gè)數(shù)據(jù)中，求出 OCV 的 X 和 SD。常規(guī)條件下已知值質(zhì)控血清變異（routineconditionsvariance-knownvalue,簡(jiǎn)稱 RCVK）的測(cè)定。做常規(guī)檢驗(yàn)的技術(shù)人員，在常規(guī)檢驗(yàn)的條件下，將質(zhì)控血清放在常規(guī)檢測(cè)

11、樣本中，進(jìn)行20 次檢驗(yàn)，結(jié)果計(jì)算同 OCV 法。一般認(rèn)為 RCV 的 SD 在 OCV 的 SD 兩倍范圍內(nèi)可以接受。若太大應(yīng)該查找原因，使其向 OCV 的 SD 值靠近。在改進(jìn)實(shí)驗(yàn)室條件后（例如較正加樣器，糾正洗板操作，調(diào)正溫育溫度等），重新進(jìn)行 RCVK 的測(cè)定。如果 RCVK 的 SD 值更小，說(shuō)明 OCV 不是最佳條件下測(cè)定的，應(yīng)重新再測(cè) OCV。常規(guī)條件下，RCVK 肯定要比 OCV 大。通過(guò)質(zhì)控控制各項(xiàng)條件，使 RCVK 的數(shù)據(jù)盡可能接近 OCV 值。RCVK 的數(shù)據(jù)反映該實(shí)驗(yàn)室日常工作的質(zhì)量，用于作質(zhì)控圖，對(duì)室內(nèi)檢驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行控制，每日檢驗(yàn)的結(jié)果，報(bào)告能否發(fā)出。常規(guī)條件下，未知

12、值質(zhì)控血清變異（routineconditionsvariancl-unknownvalue 簡(jiǎn)稱 RCVU）的測(cè)定有時(shí)為了避免主觀性，再作 RCVU 測(cè)定。測(cè)定步驟同 RCVK，但檢測(cè)的操作者不知質(zhì)控血清的定值，或在操作者不知哪份是質(zhì)控血汪清的條件下進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)，以排除操作者的主觀性。在此不再舉例說(shuō)明。質(zhì)控圖通過(guò)以上三步驟，可以開(kāi)始作室內(nèi)質(zhì)控圖，根據(jù) RCVK 的和 SD 作質(zhì)控框圖。利用質(zhì)控圖可以對(duì)每次檢驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行監(jiān)測(cè)，當(dāng)沒(méi)有更換另一批號(hào)試劑盒和另一批號(hào)質(zhì)控血清時(shí)，該質(zhì)控圖可以連續(xù)作下去。質(zhì)控血清的 S/CO 值低于-2SD 的范圍，屬告警，應(yīng)尋找原因并在質(zhì)控圖上記錄查出的原因。ELIS

13、A 試驗(yàn)中，各種檢驗(yàn)項(xiàng)目的誤差允許范圍均有待在實(shí)踐中得出結(jié)論，以上只是舉例說(shuō)明質(zhì)控方法，不是定論。2SD 是一般公認(rèn)的允許誤差限度。每批測(cè)定放一份質(zhì)控血清時(shí)，一次超過(guò) 2SD 應(yīng)作為告警，二次超出 2SD 為失控。當(dāng)質(zhì)控過(guò)程中，出現(xiàn)失控時(shí)，出現(xiàn)失控時(shí)，應(yīng)查找原因，通常是試劑盒或質(zhì)控血清失效造成。更換試劑盒或更換質(zhì)控血清，找出原因糾正后重新檢驗(yàn)。如果檢驗(yàn)結(jié)果仍達(dá)不到要求或找不到原因時(shí)，應(yīng)重復(fù)進(jìn)行 OCV的檢驗(yàn)。如果 OCV 檢驗(yàn)的結(jié)果仍是好的，說(shuō)明常規(guī)操作出現(xiàn)問(wèn)題。一般認(rèn)為：一次超出 3SD;連續(xù)二次超出 2SD;3-5 次連續(xù)處于一側(cè)的 2SD 之內(nèi)；57 次連續(xù)偏向橫軸的一側(cè)，均為失控。第、

14、種情況，單獨(dú)依靠記錄往往是不易察覺(jué)的，但在質(zhì)控圖上可以清晰地發(fā)現(xiàn)這種失控。統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算方法-即刻性質(zhì)控以上介紹的質(zhì)控方法基本上與臨床化學(xué)測(cè)定的質(zhì)控方法相同，但 ELISA 有其特殊性，最合適的質(zhì)控方法尚待研究建立。有些實(shí)驗(yàn)室不是每天進(jìn)行 ELISA 項(xiàng)目的檢驗(yàn)，而 ELSIA 試劑盒效期短，用一批號(hào)試劑盒連續(xù)常規(guī)測(cè) 20 次，難度較大。采用即刻法質(zhì)控統(tǒng)計(jì)方法，只需連續(xù)測(cè) 3 次，即可對(duì)第 3 次檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。即刻法的建立具體計(jì)算方法如下：1）先將測(cè)定值從小到大排列2）計(jì)算 X 和 SD。3）計(jì)算 SDI 上限和 SDI 下限值。4）將 SDI 上限、SDI 下限值與 SDI 值中的數(shù)字比較。

15、當(dāng) SDI 上限值和 SDI 下限值 vn2SD 時(shí)，表示處于控制范圍內(nèi)，可以繼續(xù)往下測(cè)定，繼續(xù)重復(fù)以上各項(xiàng)計(jì)算；當(dāng) SDI 上限和 SDI 下限有一值處于 n2SD 和 n2SD 值之間時(shí)，說(shuō)明該值在 2SD3SD 范圍，處于告警狀態(tài)；當(dāng) SDI 上限和 SDI 下限有一值n2SD 時(shí)，說(shuō)明該值已在 3SD 范圍之外，屬失控。數(shù)值處于告警和失控狀態(tài)應(yīng)舍去，重新測(cè)定該項(xiàng)質(zhì)控血清和病人樣本。舍去的只是失控的這次數(shù)值，其他次測(cè)定值仍可繼續(xù)使用。即刻性質(zhì)控統(tǒng)計(jì)方法，適于 ELISA 測(cè)定的質(zhì)控。當(dāng)檢測(cè)的數(shù)值超過(guò) 20 次以后，不必再使用即刻法質(zhì)控統(tǒng)計(jì)計(jì)算，可以轉(zhuǎn)入常規(guī)的質(zhì)控圖的質(zhì)控。將前20 次的數(shù)

16、值求出的和 SD 作質(zhì)控框架圖，第 21 次的數(shù)值，依次點(diǎn)入即可。1.4 室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（externalqualityassessment,簡(jiǎn)稱 EQA）室間質(zhì)量評(píng)價(jià)簡(jiǎn)稱室間質(zhì)評(píng)，是由質(zhì)控中心采用一系列的辦法連續(xù)地、客觀地評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)室內(nèi)質(zhì)控不易發(fā)現(xiàn)的不準(zhǔn)確性，了解各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的差異，并幫助校正，使具有可比性。各實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果報(bào)到質(zhì)控中心，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，得出相互比較的結(jié)果。這種評(píng)價(jià)不能控制各實(shí)驗(yàn)室每天發(fā)出的檢驗(yàn)報(bào)告，而是一種回顧性評(píng)價(jià)。室內(nèi)質(zhì)控主要監(jiān)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果的精密度，而室間質(zhì)評(píng)主要控制試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度，不能互相替代。參與質(zhì)評(píng)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)先做好室內(nèi)質(zhì)控。1.4.1 室間質(zhì)評(píng)的方法A、發(fā)質(zhì)控物進(jìn)行調(diào)查這是國(guó)內(nèi)外室間質(zhì)評(píng)的常用形式。部臨檢中心對(duì)乙肝標(biāo)志物 ELISA 檢驗(yàn)的室間質(zhì)評(píng)采用定期發(fā)放質(zhì)控物至各實(shí)驗(yàn)室，各實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定的日期進(jìn)行檢驗(yàn)，并將檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)至部臨檢中心。部臨檢中心經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，將評(píng)價(jià)結(jié)果寄回各實(shí)驗(yàn)室。通過(guò)評(píng)價(jià)，各實(shí)驗(yàn)室了