蚤休皂苷對氧化損傷臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化的影響

1、蚤休皂苷對氧化損傷臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化的影響        【摘要】     目的利用激光共聚焦顯微鏡研究蚤休皂苷（Pa）對H2O2誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304細(xì)胞）損傷的鈣離子（Ca2+）的變化及其機(jī)制。方法體外培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，建立氧化損傷的細(xì)胞模型，然后分為5個實(shí)驗處理組：正常對照組；氧化損傷組；高濃度蚤休皂苷（1 g/ml）組 ；中濃度蚤休皂苷（100 pg/ml）組；低濃度蚤休皂苷（10 pg/ml）組；應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察其細(xì)胞凋亡的

2、形態(tài)學(xué)差異。并利用激光共聚焦顯微鏡觀察、圖像分析儀分析各實(shí)驗分組細(xì)胞中游離Ca2+的表達(dá)、激光共聚焦顯微鏡描記預(yù)處理前后Ca2+的動態(tài)表達(dá)。結(jié)果損傷組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯高于正常組(P<0.01)，而各蚤休皂苷預(yù)處理組均使Ca2+熒光強(qiáng)度下降，顯著低于損傷組(P<0.01)，并呈劑量依賴性效應(yīng)。H2O2損傷劑量的刺激下，ECV304胞漿內(nèi)的游離Ca2+呈現(xiàn)雙相變化：由靜息狀態(tài)持續(xù)增加到峰值，F(xiàn)為37.22±3.72，平臺期與靜息狀態(tài)熒光值的變化P為7.65±0.69，加入蚤休皂苷預(yù)處理10 min后，再加入100 mol/L的H2O2 ，F(xiàn)和P均明顯下降(

3、P<0.01)。結(jié)論蚤休皂苷可以保護(hù)H2O2造成的ECV304細(xì)胞的氧化損傷，與抑制了鈣離子介導(dǎo)的凋亡通路有關(guān)，達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抗動脈粥樣硬化的目的。     【關(guān)鍵詞】  蚤休皂苷 內(nèi)皮細(xì)胞 凋亡 鈣離子 動脈粥樣硬化    Effects of Pariphyllin on Calcium Ion Density in Injured ECV304 Induced by Hydrogen PeroxideGAO Linlin, LI  Furong, KANG Li, SI Yanh

4、ong,WANG  Hao1.Dept of Pathophysiology, Taishan Medical College, Taian,Shandong  271000,China; 2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250014, ChinaAbstract：ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of Pariphyllin （Pa）on calcium ion density in injury ecv304 ind

5、uced by hydrogen peroxide.MethodsECV304 cells were cultured in vitro, the oxidative injury was built by hydrogen peroxide (H2O2）,cells were divided into five experimental groups:1.normal,2.oxidative damage group,3.high density Pariphyllin（1 g/ml）,4.medium density Pariphyllin （100 pg/ml）and 5.low den

6、sity Pariphyllin（10pg/ml）.Laser confocal microscopy(LCM) was used to observe quiet state and dynamic change of the density of calcium ion (Ca2+).Results The LCM showed that in damaged group, the external Ca2+ concentation was the highest,but in pretreated groups,it was decreased in dose dependent ma

7、nner（P<0.01）.H2O2 elicited an transient peak of Ca2+i and then fell to a subsequent sustained higher plateau.Pretreatment with pariphyllin（1 g/ml）for 10 minute significantly prevented the transient  increase and sustained the increase of Ca2+i.ConclusionPariphyllin has protective action agai

8、nst oxidative damage of ECV304 induced by H2O2, its mechanism may be related to decreasing the cell apoptosis and inhibiting calcium ion-decreased mediated signal transduction .Key words： Pariphyllin;   HUVEC;   Apoptosis;    Ca2+;  Atherosclerosis  

9、  內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前占主導(dǎo)地位的“損傷-反應(yīng)假說”和近來許多研究 1證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在動脈粥樣硬化中的作用。H2O2可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡在AS發(fā)生發(fā)展中起著重要作用2。有報道發(fā)現(xiàn)含蚤休的方劑能夠減輕高脂血癥大鼠動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減少內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放內(nèi)皮素3。具有保護(hù)動脈內(nèi)皮細(xì)胞和抑制主動脈中膜平滑肌增殖的功效，從而具有防治動脈粥樣硬化和高血壓病的作用。但對于蚤休皂苷保護(hù)動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷防治動脈粥樣硬化發(fā)生的作用在國內(nèi)外尚未見報道。為了進(jìn)一步探討中藥蚤休對內(nèi)皮細(xì)胞損傷的抑制機(jī)制，本實(shí)驗應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡

10、觀察其凋亡的形態(tài)學(xué)差異。并利用激光共聚焦顯微鏡觀察分析各實(shí)驗分組細(xì)胞中游離Ca2+的表達(dá)；預(yù)處理前后細(xì)胞內(nèi)Ca2+的動態(tài)表達(dá)，旨在進(jìn)一步探討蚤休皂苷對細(xì)胞損傷保護(hù)作用的機(jī)制及其之間的相互關(guān)系。1  材料與儀器1.1  材料人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304購于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心；蚤休干片（購于濟(jì)南建聯(lián)藥店），蚤休皂苷（Pariphyllin，Pa）為暗紅色粉狀結(jié)晶，由泰山醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)教研室提取鑒定，每0.5 kg蚤休干片得到皂苷結(jié)晶27 g，純度為98.79%。用RPMI1640（Gibico公司，美國）培養(yǎng)液稀釋至1 000，100，10 pg/ml，微孔濾膜過濾除

11、菌，-20保存?zhèn)溆茫?熒光探針Fluo-3/ AM (Molecular Probes Inc產(chǎn)品，美國)溶于DMSO中，配成貯存液，放于-20冰箱保存；HEPES緩沖液(mmol/L )等試劑購于濟(jì)南聯(lián)星生物試劑公司。1.2 儀器激光共聚焦顯微鏡：美國Bio-Rad  Radiance  2100。2 方法2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)將ECV304細(xì)胞在37，5%CO2條件下培養(yǎng)，以含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/ml，按每瓶2 ml接種于25 ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每48 h更換培養(yǎng)液1次。待細(xì)胞融合率為70%80%時，無血清培養(yǎng)12

12、h后使細(xì)胞同步化于G0期，然后按分組分別加藥進(jìn)行預(yù)處理24 h，再加入氧化損傷藥物H2O2，終濃度為100 mol/L，作用12 h。細(xì)胞分組如下：正常對照組:不加任何藥物的培養(yǎng)基；氧化損傷組: H2O2終濃度為100 mol/L；蚤休皂苷高、中、低劑量預(yù)處理組: （1 g/ml，100 pg/ml，10 pg/ml），調(diào)整各組細(xì)胞濃度為5×105×106個/ ml。2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察各處理組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度的含量 將ECV304制成105個/ml的細(xì)胞懸液接種于35 mm Petri細(xì)胞培養(yǎng)皿中，實(shí)驗分組加藥同上， 孵育24 h后用HEPES緩沖液洗滌

13、兩遍，加入終濃度為10 mol/L的Fluo-3/AM 37負(fù)載。40 min后再用HEPES緩沖液洗滌2次，立即置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。實(shí)驗中選用512線光束掃描成像，圖像分辨率為512×512像素，采集頻率0.20.5 Hz。使用Simple PCI軟件收集Ca2+圖像、分析Ca2+的改變。每個處理組選取大約30個細(xì)胞，記錄平均熒光強(qiáng)度，以此來衡量ECV304內(nèi)游離Ca2+的水平。2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察各處理組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的動態(tài)變化 按以上所述負(fù)載ECV304，設(shè)定激光共聚焦顯微鏡激發(fā)波長為488 nm，掃描方式

14、為時間掃描，時間間隔為每5 s一個循環(huán)，連續(xù)掃描600個循環(huán)。首先觀測靜息狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，然后預(yù)先加入終濃度為1 g/ml的蚤休皂苷，10 min 后加入H2O2 ，終濃度為100 mol/L；動態(tài)觀測細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的變化，使用Simple PCI軟件收集Ca2+圖像、Microsoft Excel 2000分析并繪制成熒光強(qiáng)度隨時間變化的時間-效應(yīng)曲線。實(shí)驗所測定染色條件和激光掃描參數(shù)在整個實(shí)驗過程中不變，每實(shí)驗組先后測定3次。2.4 統(tǒng)計學(xué)處理實(shí)驗數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS 12.0軟件包分析對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行one-way ANOVA分析及LSD兩兩比較。P<

15、0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3 結(jié)果3.1 激光共聚焦顯微鏡觀察各處理組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度的含量  各處理組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度的含量培養(yǎng)的ECV304負(fù)載Fluo-3/AM后，F(xiàn)luo-3和游離Ca2+結(jié)合，在488nm波長的光激發(fā)下，可觀察到熒光，其在胞漿內(nèi)的分布較均勻，結(jié)果顯示，H2O2損傷引起ECV304細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯高于正常組(P<0.01)，而各蚤休皂苷預(yù)處理組均使Ca2+熒光強(qiáng)度下降，顯著低于損傷組(P<0.01)。且此效應(yīng)呈濃度依賴性(P<0.01)。結(jié)果見表1。表1  Pa對細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+平均熒光強(qiáng)度的影響(

16、略)3.2 激光共聚焦顯微鏡觀察各處理組細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的動態(tài)變化  H2O2損傷劑量的刺激下，ECV304胞漿內(nèi)的游離Ca2+呈現(xiàn)雙相變化：由靜息狀態(tài)持續(xù)增加到峰值，ECV304細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度值從靜息狀態(tài)時的15.56±1.57，迅速升高到峰值58.77±6.24，峰值熒光變化F為37.22±3.72，之后下降至22.17±2.09，并維持于平臺期，平臺期與靜息狀態(tài)熒光值的變化P為7.65±0.69，加入蚤休皂苷預(yù)處理10 min后，再加入100mol/L的H2O2 ，F(xiàn)和P的變化見圖1；與H2O2組差異顯著(P&

17、lt;0.01)，見表2。表2  Pa對細(xì)胞內(nèi)動態(tài)Ca2+平均熒光強(qiáng)度的影響(略)4 討論    蚤休,又稱七葉一枝花。其基源為百合科重樓屬的多種植物。藥用歷史悠久,其以蚤休之名首載于神農(nóng)本草經(jīng)，唐本草收錄別名為重樓，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效。蚤休的藥理活性多樣，近年來國內(nèi)外學(xué)者著眼于其生理活性和獨(dú)特的藥用價值，運(yùn)用現(xiàn)代藥理方法，為中藥蚤休的一些臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，同時也發(fā)現(xiàn)了它的一些新作用4。    為研究蚤休皂苷對過氧化損傷后所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，在實(shí)驗中我們采用熒光染料Fluo-3/AM結(jié)合激光

18、掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+，其原理是Fluo-3與游離Ca2+有特異性親和力，對游離Ca2+濃度變化非常敏感。其本身不能透過細(xì)胞膜，但與酯性基團(tuán)AM連接后可導(dǎo)入細(xì)胞。Fluo-3/AM導(dǎo)入細(xì)胞后，在胞內(nèi)非特異性酯酶水解作用下釋放出Fluo-3， Fluo-3通常不被細(xì)胞器分隔，其與胞漿游離Ca2+結(jié)合后可被一定波長的光激發(fā)產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度與游離Ca2+濃度成正比。Ca2+濃度越多，熒光強(qiáng)度越大，因此是目前最理想的檢測細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的方法之一。    激光共聚焦顯微鏡顯示，蚤休皂苷干預(yù)后，深紅色的胞核顯著減少，晚期凋亡量減少；各蚤休皂苷預(yù)處理組均使

19、Ca2+熒光強(qiáng)度下降，顯著低于損傷組，因此，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，同時長時間的鈣超載又會引起細(xì)胞的死亡，這些作用可能是H2O2導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞存活率下降的原因之一。H2O2升高可以引起內(nèi)皮細(xì)胞存活率下降，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而升高誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡與H2O2升高細(xì)胞內(nèi)游離鈣以及激活有關(guān)。        外源性H2O2孵育引起ECV304內(nèi)游離Ca2+濃度明顯高于正常組，進(jìn)一步作動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)ECV304給予H2O2后所致胞內(nèi)Ca2+升高呈雙相變化：先快速增加到峰值，爾后下降維持于平臺期，平臺期Ca2+值介于峰值和靜息值之間。 &

20、#160;  細(xì)胞內(nèi)Ca2+是一種重要的第2信使，機(jī)體細(xì)胞的許多生理活動均依賴于鈣的參與5。正常生理機(jī)制對細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的調(diào)控是有一定限度的,超過極限將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高,引起細(xì)胞和線粒體鈣超載,從而觸發(fā)一系列有害的病理生理過程, 細(xì)胞內(nèi)游離鈣作為重要的信使參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié),介導(dǎo)細(xì)胞對刺激的反應(yīng)6。本實(shí)驗觀測到H2O2可引起內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+顯著升高,并呈現(xiàn)出時間依賴性。鈣超載可引起線粒體功能障礙及酶的激活,促進(jìn)膜磷脂酶分解,產(chǎn)生脂肪酸、白三烯、溶血磷脂等,對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。有資料表明7,細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高可以激活核酸內(nèi)切酶,使基因組DNA產(chǎn)生特征性降解,

21、對細(xì)胞凋亡起重要作用。本實(shí)驗的氧化損傷后細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度達(dá)到高水平，蚤休皂苷干預(yù)后，表現(xiàn)為劑量依賴性地降低了其濃度，說明了皂苷具有防止鈣離子超載的作用。       由實(shí)驗結(jié)果可以推測，蚤休皂苷可以通過穩(wěn)定氧化損傷的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的Ca2+，達(dá)到抑制細(xì)胞的凋亡作用以及保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于氧化損傷，阻止動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生。但是，蚤休皂苷通過哪種途徑抑制了H2O2誘導(dǎo)的游離鈣升高引起細(xì)胞凋亡，還應(yīng)在蛋白質(zhì)表達(dá)的水平上作進(jìn)一步的研究。    【參考文獻(xiàn)】  1Croce K, L ibby P. Inte

22、rtwining of thrombosis and inflammation in atheroscle-r osisJ.Curr Opin Hematol, 2007,14(1):55.2Houtkamp MA, De Boer OJ, van der Loos CM, et al. Adventitial infiltrates associated with advanced atherosclerotic plaques: structural organization suggests generation of local humoral immune responsesJ.J Pathol 2001，193(2):263.3Hou YZ, Yang J,Zhao GR ,et al.Feru