蛋白質(zhì)組學(xué)解析正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)復(fù)合物

1、蛋白質(zhì)組學(xué)解析正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)復(fù)合物    肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一,是我國(guó)位居第二的癌癥“殺手”。目前,對(duì)于肝癌的發(fā)病機(jī)制一直不太清楚。DNA損傷修復(fù)失敗被認(rèn)為是發(fā)生癌癥的一個(gè)重要原因。其中,DNA雙鏈斷裂(DSB)是一種最嚴(yán)重的DNA損傷,可以在如細(xì)胞減數(shù)分裂的同源染色體重組、V(D)J重組及某些DNA損傷修復(fù)等生理過程中作為中間產(chǎn)物產(chǎn)生;也可以在外源性電離輻射和DNA斷裂劑如抗癌藥物、遺傳毒物等損害過程中產(chǎn)生。如果DSBs產(chǎn)生的傷害不能修復(fù),將可能直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前,DBS重組修復(fù)相關(guān)的蛋白復(fù)合物的研究及其對(duì)細(xì)胞和生

2、物體的影響已成為分子生物學(xué)研究熱點(diǎn),特別是其對(duì)腫瘤形成、發(fā)展和防治的影響已受到廣泛關(guān)注。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,如二維電泳、質(zhì)譜、HPLC等,為我們研究這些相互作用的復(fù)合物打下了很好的基礎(chǔ)。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)室首創(chuàng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(amino acid-coded mass tagging,AACT)技術(shù),也將為相互作用復(fù)合物的研究添磚加瓦。本論文主要以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(AACT)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的定量技術(shù)平臺(tái),選擇了具有相同遺傳學(xué)背景的正常肝細(xì)胞7701與肝癌細(xì)胞7703,詳細(xì)研究了DNA損傷修復(fù)信號(hào)通路上的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白H2AX、RAD52的蛋白相互作用復(fù)合物的組成變化

3、情況。第一章的第一部分綜述了DNA損傷修復(fù)通路的研究情況,特別是與DNA雙鏈斷裂相關(guān)的DNA損傷修復(fù)通路,重點(diǎn)介紹了DSB相關(guān)的一些重要的修復(fù)蛋白及其復(fù)合物的作用方式;并探討了DNA損傷修復(fù)蛋白與腫瘤的關(guān)系。第二部分介紹了目前大規(guī)模研究蛋白質(zhì)相互作用的有關(guān)技術(shù),引入我們的研究技術(shù)平臺(tái)。通過這兩部分的內(nèi)容介紹了本論文的研究背景。文中最后闡述了本論文的研究目的和意義。論文的研究工作主要包括兩個(gè)部分,分別研究與H2AX、RAD52相關(guān)的相互作用復(fù)合物的表達(dá)情況,分述如下:(一)蛋白質(zhì)組學(xué)解析H2AX相關(guān)的蛋白相互作用復(fù)合物的研究H2AX是組蛋白H2A的一種變體,于1980年首次在人類細(xì)胞中被識(shí)別為核

4、心蛋白H2A的同形物,隨后于80年末得到測(cè)序。研究發(fā)現(xiàn),DNA損傷后核心組蛋白的化學(xué)修飾能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變,從而促進(jìn)DNA的修復(fù)。組蛋白H2A家族包括H2A1、H2A2、H2AZ和H2AX,其中H2AX在H2A中含量很少,但在DNA損傷信號(hào)的分子感應(yīng)和染色質(zhì)代謝中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。當(dāng)電離輻射和其它因素使DNA發(fā)生雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSBs)或者細(xì)胞自身代謝產(chǎn)生的DNA DSBs時(shí),H2AX快速發(fā)生磷酸化,引起相應(yīng)信號(hào)通路的改變,富集DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白,修復(fù)相應(yīng)DNA損傷。研究發(fā)現(xiàn)DSBs損傷修復(fù)復(fù)合物的組成性活化,是腫瘤形成早期所激活的細(xì)胞

5、內(nèi)可誘導(dǎo)的抗癌屏障,其信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的精確、精細(xì)調(diào)控在基因組穩(wěn)定性維持中發(fā)揮重要作用。為了深入了解這一過程,本章采用氨基酸同位素代謝標(biāo)記和表位標(biāo)記的雙標(biāo)記策略(AACT),分別構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)帶有標(biāo)簽的H2AX的7701和7703穩(wěn)定細(xì)胞系為研究對(duì)象,并結(jié)合免疫共沉淀、高效液相色譜、質(zhì)譜等實(shí)驗(yàn)方法,從整體上全面的研究了與H2AX蛋白相互作用的蛋白復(fù)合物在正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況,并研究其主要作用方式,嘗試了解每一個(gè)蛋白在信號(hào)通路的功能。表位標(biāo)記的方法提高了免疫沉淀效率,增加蛋白復(fù)合物富集,提高鑒定的效率;而以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的氨基酸同位素代謝標(biāo)記的定量方法可以有效去除非特異性結(jié)合蛋白,并實(shí)現(xiàn)蛋白間的

6、定量。借助這種策略,我們構(gòu)建了三個(gè)實(shí)驗(yàn)組,分別鑒定在7701中與H2AX相互作用的蛋白質(zhì)、在7703中與H2AX相互作用的蛋白質(zhì)、在7701和7703同時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)的量的變化。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析的結(jié)果顯示,除了靶蛋白外,我們?cè)?701細(xì)胞和7703細(xì)胞中分別獨(dú)立鑒定到85和145個(gè)相互作用的蛋白質(zhì),在7701細(xì)胞和7703細(xì)胞定量組中鑒定更多的蛋白,包括了幾乎所有在7701和7703單獨(dú)鑒定到的蛋白。我們?cè)谡撐牡挠嘘P(guān)部分詳細(xì)討論了這一結(jié)果。在鑒定到的蛋白質(zhì)中包括已知相互作用的蛋白如PRAP-1、KU70、組蛋白H4等多個(gè)蛋白;以及許多未經(jīng)報(bào)道的蛋白,如CFL、PPMlG及一些核糖體蛋白等被首次報(bào)道

7、。對(duì)于鑒定到的部分蛋白,我們進(jìn)行了Western blot、激光共聚焦顯微鏡掃描驗(yàn)證,結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果一致。此外,我們探討了這些蛋白在信號(hào)通路中的功能及作用方式。對(duì)于鑒定到的全部蛋白質(zhì),進(jìn)行了生物學(xué)功能分類分析。發(fā)現(xiàn)鑒定到的蛋白涉及多種生物功能,包括細(xì)胞周期、凋亡、DNA代謝和RNA代謝外,還涉及糖代謝、電子轉(zhuǎn)移、多種輔酶系統(tǒng)等等,進(jìn)一步證明腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多基因參與的過程。之后,我們檢測(cè)了在博來霉素刺激條件下,鑒定到的蛋白的結(jié)合量的變化情況,結(jié)果顯示PARP-1、KU70、HSP60、CFL等結(jié)合量上升,進(jìn)一步證明了這些蛋白參與了DNA損傷修復(fù)。在我們的實(shí)驗(yàn)中還嘗試了同一體系中比較相互作用復(fù)合

8、物的量的變化的新方法。我們將構(gòu)建好的H2AX帶有標(biāo)簽的穩(wěn)定細(xì)胞株7701/7703細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記,同相應(yīng)的構(gòu)建好的非穩(wěn)定同位素標(biāo)記的H2AX帶有標(biāo)簽的穩(wěn)定細(xì)胞株7703/7701混合完成實(shí)驗(yàn),最后通過對(duì)所帶標(biāo)簽的質(zhì)譜定量結(jié)果的同一化,得到相同蛋白在不同細(xì)胞中的表達(dá)量的相對(duì)定量。因?yàn)槭褂昧送贿z傳背景的細(xì)胞,所以有效避免了不同個(gè)體混合帶來的差異。結(jié)果顯示,許多基因在復(fù)合物中的結(jié)合量是不同,提示正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞在DNA修復(fù)通路上存在差異。最后,通過對(duì)本組建立的一個(gè)肝癌動(dòng)物模型的組織切片的免疫組織化學(xué)分析,比較了在從正常肝細(xì)胞到肝癌這一過程中部分DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的變化情況,研究了它

9、們?cè)诟伟┌l(fā)生發(fā)展中的變化情況,希望能找到有潛在臨床意義的腫瘤標(biāo)志物。(二)蛋白質(zhì)組學(xué)解析RAD52相關(guān)的蛋白相互作用復(fù)合物的研究RAD52屬于RAD52家族,目前已發(fā)現(xiàn)成分有RAD50、RAD51、RAD51B、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RAD59等,還不斷有新成分被發(fā)現(xiàn)。RAD52主要通過DNA的同源重組(HR)與非同源末端連接修復(fù)DSBs。新的研究發(fā)現(xiàn)RAD52可能在DNA損傷修復(fù)的多個(gè)環(huán)節(jié)起作用,并與多種DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)的活化有密切關(guān)系。本章運(yùn)用了與上一章相同的策略,采用氨基酸同位素代謝標(biāo)記和表位標(biāo)記的雙標(biāo)記策略,構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)帶有標(biāo)簽的RAD52的770

10、1細(xì)胞系和7703穩(wěn)定細(xì)胞系,并結(jié)合免疫共沉淀、SDS-PAGE,LC-MS的實(shí)驗(yàn)方法,研究了與RAD52蛋白相互作用的蛋白復(fù)合物在正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。同樣的,我們將實(shí)驗(yàn)分為三組,分別在7701細(xì)胞中鑒定到了與RAD52相互作用的復(fù)合物89個(gè),在7703細(xì)胞中鑒定到了與RAD52相互作用的復(fù)合物129個(gè);同時(shí)在定量組中鑒定到在7701細(xì)胞中與RAD52結(jié)合量上調(diào)的蛋白60個(gè),在7703細(xì)胞中與RAD52結(jié)合量上調(diào)的蛋白90個(gè)。對(duì)于鑒定到的全部復(fù)合物進(jìn)行了詳細(xì)的功能分類,發(fā)現(xiàn)這些蛋白的功能主要集中在對(duì)生物合成、細(xì)胞間代謝、糖分解代謝、細(xì)胞防御反應(yīng)、凋亡、核酸代謝、細(xì)胞定位、氨基酸代

11、謝、羧酸代謝、細(xì)胞蛋白代謝、化學(xué)刺激的反應(yīng)物等方面。通過比較7701細(xì)胞與7703細(xì)胞中這些復(fù)合物功能異同發(fā)現(xiàn),7703細(xì)胞中鑒定到了一類抗凋亡蛋白,而7701中鑒定到了一類與防御相關(guān)及對(duì)化學(xué)刺激防御的應(yīng)答蛋白。這一結(jié)果提示在正常的肝細(xì)胞和癌細(xì)胞中DNA修復(fù)復(fù)合物確實(shí)不同,正常細(xì)胞的DNA修復(fù)復(fù)合物傾向于維持基因組的穩(wěn)定性,保持細(xì)胞內(nèi)部的穩(wěn)態(tài)平衡;癌細(xì)胞則傾向于對(duì)錯(cuò)誤修復(fù)的逃逸,造成細(xì)胞的永久性生長(zhǎng)。同主題文章1.    張昶,白玲,陳昊. 抑凋亡基因Bcl-X_L在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及與Fas、FasL的關(guān)系' J. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 200

12、1.(11)    2.    陳佩蘭,陳乃玲,劉超英,李琳,陳良標(biāo). 丙型肝炎肝細(xì)胞凋亡的電鏡和免疫組化研究' J. 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 1999.(01)    3.    王允610041成都,周清華610041成都,黃頤610041成都,張尚福610041成都,成娘610041成都,張宏偉610041成都. 人肺癌中細(xì)胞增殖、凋亡水平與預(yù)后的關(guān)系研究' J. 腫瘤防治研究. 2001.(05) 

13、0;  4.    郭琳瑯,曹長(zhǎng)安. Bcl-2及相關(guān)蛋白bax在人肝膽管癌中的表達(dá)及意義' J. 臨床肝膽病雜志. 1998.(02)    5.    李月白,李家謀,王義生,于明達(dá),丁力,杜慶民,許建中. 骨巨細(xì)胞瘤中PCNA、p16、Rb與bcl-2基因表達(dá)及凋亡的檢測(cè)研究' J. 河南醫(yī)學(xué)研究. 1998.(02)    6.    曾先捷,姚潔民,鄺

14、曉聰,莫立根,許堅(jiān),楊榮寧,楊劍波,李偉,張哲,顏獻(xiàn)輝,黃菊. P(53)、bcl-2、c-fos基因在腦膠質(zhì)瘤表達(dá)及意義' J. 廣西醫(yī)學(xué). 2000.(03)    7.    王瑾,許峰. 調(diào)節(jié)放射反應(yīng)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)' J. 國(guó)外醫(yī)學(xué).腫瘤學(xué)分冊(cè). 1998.(05)    8.    白吉可,張瀾,李華. 醫(yī)學(xué)心理學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型概述' J. 科技風(fēng). 2010.(05)    9.    唐國(guó)都,黃杰安,陳振儂. 幽門螺桿菌感染的慢性胃炎Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系' J. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2001.(01)    10.    曾先捷,姚潔民,鄺曉聰,許