Bradford法測(cè)蛋白質(zhì)濃度

1、Bradford 法測(cè)蛋白質(zhì)濃度一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐渲埔唤M濃度分別為 0.10mg/ml ， 0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ， 0.02mg/ml, 0 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）溶液，測(cè)定這組溶液的吸光度，得到 蛋白質(zhì)濃度對(duì)吸光度的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 測(cè)定未知蛋白質(zhì)濃度樣品的吸光度， 根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白質(zhì)的濃度。二、實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)（CBB）測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)在 游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在 488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋?質(zhì)色素結(jié)合物在 595nm 波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正 比，因此可用于蛋

2、白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下 1h 內(nèi)保持穩(wěn)定。該法試 劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比 Lowry 法還高 4倍，可測(cè) 定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為01 000 ”gl，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。三、實(shí)驗(yàn)過程1準(zhǔn)備所需的藥品和儀器。 2計(jì)算所需配制的溶液的量。先配制1 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸緩沖溶液（PBS）配制一組濃度分別為 1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml 的 BSA 溶液，再將這組溶

3、液稀釋 10 倍，得到一組濃度分別為0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ， 0.04mg/ml ，0.02mg/ml 的 BSA溶液。計(jì)算第一步稀釋各組需要的BSA溶液及PBS溶液的體積BSA體積(ul)10080604020PBS體積(ul)900920940960980BSA濃度(mg/ml)1.00.80.60.40.23具體操作過程。用天平稱量I.OOg牛血清蛋白（BSA）,溶于去離子水中，配成100ml的溶液， 溶液的濃度為10mg/ml。用移液槍分別取 100ul, 80ul，60ul, 40ul，20ul的BSA 溶液，置于1.5ml的EP管中，再分別加

4、入 900ul, 920ul, 940ul, 960ul, 980ul的 磷酸緩沖溶液（PBS配成1ml的溶液，震蕩使溶液混合均勻。得到一組濃度分 另為 1.0mg/ml , 0.8mg/ml, 0.6mg/ml , 0.4mg/ml , 0.2mg/ml 的 BSA溶液。移液槍分別移取100ul剛配好的一組BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，各 加入900ul的PBS溶液，震蕩使溶液混合均勻。得到一組濃度分別為0.10 mg/ml , 0.08mg/ml, 0.06mg/ml , 0.04mg/ml , 0.02mg/ml 的 BSA 溶液。另外量取 1ml 的PBS溶液（BSA溶液濃度為

5、0 mg/ml）作對(duì)照試驗(yàn)。用移液槍分別移取50ul配好的一組BSA溶液，滴加到孔板中，再分別加入 200ul的考馬斯亮藍(lán)（CBB）。靜置10min后，用酶標(biāo)儀測(cè)得這組BSA溶液的吸光 度。四、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理測(cè)得的BSA溶液的吸光度如下:BSA濃度(mg/ml)0.100.080.060.040.020吸光度0.9710.9230.8740.8470.7460.650用orgin作出吸光度對(duì)BSA濃度的關(guān)系曲線y=3 09x+0.6807Ra-0.954109-0.8070611111<r-0 000.020.040.06 0.CS 0.10BS/V農(nóng)專 mg/ml五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得到的吸光度對(duì)BSA濃度的關(guān)系曲線為y=3.09x+0.6807 R2=0.9541?？梢钥闯鑫舛纫粷舛鹊年P(guān)系曲線中 R2值較小，即測(cè)得的吸光度與濃度的線性不是很 好。究其原因可能有以下兩點(diǎn)：一是移液槍的操作不