局部應用兩性霉素B脂質體滴眼治療兔曲霉菌性角膜潰瘍的效果

1、局部應用兩性霉素B脂質體滴眼治療兔曲霉菌性角膜潰瘍的效果         11-03-04 13:50:00     編輯：studa20                  作者：王亮，張林，吳潔，劉先寧【摘要】  目的：探討兩性霉素B脂質體(AmBL)對兔實驗性曲霉菌性角膜潰瘍的治療作用。方法：用

2、40只新西蘭白兔,采用角膜”#”形劃痕法制作實驗性曲霉菌性角膜潰瘍模型，隨機分為4組，每組10眼。A組應用5g/L AmBL滴眼液點眼,B組應用2.5g/L AmBL滴眼液點眼，C組應用5g/L兩性霉素B滴眼液（AmBS）點眼，D組應用生理鹽水點眼作對照。造模后第3d每15min點眼1次,共點眼4次,后改為每天點眼6次,并于造模后3,5,7,10,15d,用裂隙燈顯微鏡觀察結膜充血,角膜水腫,角膜浸潤的范圍,角膜新生血管,房水閃輝,前方積膿的水平作為得分,并進行角膜刮片,角膜共焦纖維鏡,角膜組織病理切片及培養(yǎng)觀察真菌的生長程度。結果：A，B組造模后3，5d角膜水腫，角膜浸潤范圍，前房積膿，結膜

3、充血均與其它組無明顯差別，造模后7，10d，較其它組顯著減輕,造模后15d,各組間無明顯差異。A組，B組，與C組，D組在造模后7d角膜新生血管存在明顯差異,造模后10d,15d無明顯差異。4組間在造模后7,10d角膜刮片及角膜病理學檢查存在明顯差異,造模后15d無明顯差異。結論：AmBL眼液能有效抑制曲霉菌性角膜潰瘍的進展, 5g/L AmBL及2.5g/L AmBL均有良好的耐受性，治療效果無顯著差異。 【關鍵詞】  曲霉菌；角膜潰瘍；兩性霉素B；脂質體AbstractAIM：To evaluate the efficacy of topical amphotericin B li

4、mposome(AmBL) injection in the management of keratomycosis in a rabbit model.METHODS: Forty New Zealand White rabbits model of aspergillus keratitis were randomized into four groups (groups A, B, C and D), with 10 eyes in each group. Group A were treated with 5g/L AmBL, group B 2.5g/L AmBL, group C

5、were treated with 5g/L amphotericin B eye drop (AmBS), group D were treated with normal saline as the control group. After 3 days, treatments were performed every 15 minutes, totally for 4 times, then it changed to six times per day. Eye examinations were performed after 3, 5, 7, 10, 15 days. Quanti

6、tation of fungi in the cornea was achieved by culturing homogenates and counting colonyforming units.RESULTS: Corneal edema, corneal infiltration range, hypopyon, and conjunctival hyperemia revealed that after 7, 10 days treatment, group A, B was significantly different compared to the other groups

7、(P<0.01), but not at day 3,5. Corneal new vessels in groups A, B were significantly different compared to groups C, D after 7 days treatment but not different after 10, 15 days. Quantitative cultures in groups A, B were significantly different compared to groups C, D after 7, 10 days treatment.CO

8、NCLUSION: Intracameral AmBL injection can effectively inhibit the progress of keratomycosis. 2.5g/L AmBL and 5g/L AmBL are not significantly different in therapeutic effect.     KEYWORDS: aspergillus; corneal ulcer; amphotericin B; liposome0引言       

9、 真菌性角膜潰瘍和真菌性眼內炎作為高致盲性眼病由于發(fā)病率有逐年增長的趨勢，近年來越來越被受到重視。其臨床表現(xiàn)呈復雜多樣性，臨床診斷困難，確診常需要病原學檢查，如組織刮片檢查、真菌培養(yǎng)等。而許多抗真菌藥物由于穿透性差、局部刺激性和毒性大，易產(chǎn)生耐藥性等,使應用受到限制。兩性霉素B是一種古老的抗真菌藥物，由于副作用大而較少使用，但其新劑型即兩性霉素B脂質體由于增強了組織穿透性、降低了副作用，真菌抗藥性低1，在真菌性角膜潰瘍的治療中越來越受到重視。我們探討兩性霉素B脂質體對兔曲霉菌性角膜潰瘍的治療作用。    1材料和方法    1.1材料

10、 兩性霉素B脂質體滴眼液采用兩性霉素B脂質體（上海新先鋒藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）粉劑，使用滅菌注射用水配制成5g/L及2.5g/L溶液，避光4保存。兩性霉素B眼液采用兩性霉素B（華北制藥集團生產(chǎn)）粉劑，使用滅菌注射用水配制成5g/L溶液，避光4保存。曲霉菌菌株由陜西省眼科研究所提供。標準菌株接種于沙保氏培養(yǎng)基，置37培養(yǎng)。真菌懸液制備:培養(yǎng)標準菌株35d，見菌落形成后,在無菌條件下用接種環(huán)取少許菌落,置于無菌注射用水中，充分振蕩混勻,于紅細胞計數(shù)板上計數(shù)孢子數(shù)量,并調整菌懸液密度至106cfu /L備用。    1.2方法 角膜潰瘍模型制作:新西蘭白

11、兔40只,在無菌條件下刮去兔角膜上皮做為植床，將內皮面作”#”形劃痕的保存兔角膜植片，用100尼龍縫線放射性縫合在受體角膜上，將曲霉菌混懸液0.1mL注入植片與植床間，縫合上下眼瞼，建立模型。3d后拆除眼瞼縫線，去除角膜植片，觀察角膜情況。按隨機數(shù)字表法分4組，每組10兔10眼。造模后3d開始點眼。 A組應用5g/L AmBL點眼，B組應用2.5g/L AmBL點眼，C組應用5g/L AmBS點眼， D組生理鹽水點眼作為對照。造模后3d每15min點眼1次，共點眼4次，后改為6次/d。造模后3，5，7，10，15d，用裂隙燈顯微鏡觀察結膜充血，角膜水腫，角膜浸潤的范圍，角膜新生血管，房水閃輝，

12、前房積膿的水平作為得分，并進行角膜刮片，角膜共焦顯微鏡檢查，角膜組織病理切片及培養(yǎng)觀察真菌的生長程度2。結膜充血的等級為：0級：無充血；1級：少量充血；2級：中度充血；3級：重度充血。角膜水腫的分級：0級：角膜清亮；1級：局部水腫；2級：大于兩個象限的角膜水腫；3級：全角膜水腫。角膜新生血管的分級：0級：無新生血管；1級：新生血管距角膜緣2mm；2級：新生血管距角膜緣>2mm但未到角膜中央；3級：新生血管到達角膜中央。房水閃輝參照Sander標準：0級：無（光束透明）；1級：輕度（微弱發(fā)白光束）；2級：中度（中度乳白光束，可辨別虹膜和晶狀體細節(jié)）；3級：顯著（明顯乳白光束，難以辨別虹膜和

13、晶狀體細節(jié)）；4級：嚴重（房水成凝固狀態(tài)，伴大量纖維素性滲出物）。臨床得分為上述分值相加，以均數(shù)±標準差表示。角膜刮片檢查：造模后5，7，10，15d進行角膜刮片，3.9mol/L氫氧化鉀濕片法檢查，并進行角膜共焦顯微鏡檢查。每組隨機選取1兔，采用耳緣靜脈注射空氣法處死，取病變角膜制作病理切片45張，厚6m，隨機抽簽法選取16張，分別行蘇木素2伊紅(HE)及過碘酸雪夫( PAS)染色各8張。    2結果    2.1裂隙燈顯微鏡檢查 接種真菌的40只兔眼均一次接種成功，在接種后3d可觀察到淺層角膜真菌病變。結膜囊

14、有黃白色分泌物，結膜充血，病變角膜與健康角膜邊界清晰，角膜表面粗糙，輕度隆起，基質混濁水腫，部分出現(xiàn)前房積膿(圖1A)，虹膜無新生血管。3d開始點眼。7d A和B組結膜充血、角膜水腫較d明顯減輕，角膜新生血管較5d增多，但兩組之間無明顯差異；C組比A,B組結膜充血、角膜水腫癥狀嚴重，角膜新生血管較少，部分可見前房積膿；D組可見明顯潰瘍灶并有苔垢樣壞死組織附著，潰瘍邊緣稍隆起毛糙不齊，部分周邊可見衛(wèi)星灶，內皮面有內皮斑，角膜彌漫性霧狀水腫，前房可見積膿，虹膜可見新生血管(圖1B)。 A，B組平均10d角膜水腫消失，瘢痕形成；C,D組15d時上皮基本愈合,可見瘢痕形成。3.9moL/L氫氧化鉀濕片

15、法檢查，5d，4組均可查見菌絲、孢子(圖2)。角膜標本接種于Sabouraud培養(yǎng)皿上,將其置于25下培養(yǎng)觀察可見曲霉菌菌落形成(圖3)。第7d A，B組未檢出菌絲及孢子，C,D組未見菌絲,部分可見孢子，10d C組未見到孢子，D組有少量孢子。15d D組也未能檢出孢子。表1  術后不同時間點各組兔眼結膜充血，房閃及新生血管的分級情況（±s，n=10）2.2角膜共焦顯微鏡檢查 術后5d：4組均可見較直，短，分支比較少的高反光菌絲及圓形分生孢子，菌絲以垂直生長方式為主，伴有少量炎性細胞浸潤。術后7d:大量高反光,較直,長的菌絲,以垂直生長方式為主，圓形分生孢子聚集其周，伴有較多炎性細胞浸潤(圖4A)。A組，B組菌絲多見于角膜深基質層，C，D組角膜全層均可見菌絲及孢子。術后10d:4組均可見高反光菌絲及孢子明顯減少(圖4B),其周圍有較多炎性細胞浸潤，A,B組見較多瘢痕反光，C,D組可見部分瘢痕反光。術后15d:極少數(shù)斜形生長菌絲可見，C,D組也可見到角膜基質細胞明顯減少，較多斑片狀瘢痕組織可見(表1)。    2.3病理學檢查 術后第5d，4組PAS染色均可見少量菌絲平行生長于膠原