牛透明軟骨細(xì)胞與組織引導(dǎo)再生膠原膜體外培養(yǎng)后植入體內(nèi)的研究

1、    牛透明軟骨細(xì)胞與組織引導(dǎo)再生膠原膜 體外培養(yǎng)后植入體內(nèi)的研究        【摘要】目的解決修復(fù)重建組織器官缺損所需移植材料的問(wèn)題，利用組織工程技術(shù)，進(jìn)行組織工程牛透明軟骨的實(shí)驗(yàn)研究。方法用分離獲得的牛軟骨細(xì)胞，與醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜體外聯(lián)合培養(yǎng)1周后，以軟骨細(xì)胞可降解材料復(fù)合物的形式植入裸鼠體內(nèi)，8周后對(duì)所獲得的組織工程軟骨樣組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。結(jié)果在實(shí)驗(yàn)獲得的組織工程軟骨樣組織中有軟骨細(xì)胞的存在，并且可以分泌硫酸軟骨素。證實(shí)為組織工程牛透明軟骨。結(jié)論實(shí)

2、驗(yàn)結(jié)果表明應(yīng)用組織工程技術(shù)，在體外進(jìn)行組織工程軟骨的制作，可能成為解決整形外科領(lǐng)域修復(fù)缺損用移植材料不足的方法之一?！娟P(guān)鍵詞】軟骨細(xì)胞醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜體外培養(yǎng)組織工程學(xué) A study on guided tissue regeneration and tissue engineering-transplantation of collagen membrane seeded with cultured hyaline chondrocytesSONG Yeguang, MA Haihuan, CAI Zhe, et al.Plastic Surgery Hospital, Chines

3、e Academy of Medical Sciences, Beijing 100041【Abstract】 Objective Lack of transplant material is a main problem in the repair and reconstruction of tissue or organ defects. To seek the succedaneum of transplants, we studied and used tissue-engineered growth hyaline cartilage.Methods The articular hy

4、aline cartilage obtained from newborn calf within 6 hours of sacrifice was enzymatically dissolved. The chondrocytes were then seeded onto the medical collagen membrane of guided tissue regeneration in a 24 well plate in RPMI1640 medium. One week later, the chondrocyte medical collagen membrane of g

5、uided tissue regeneration complex was implanted subcutaneously into the back of nude mice. Eight weeks after implantation, the animals were sacrificed.Results The present study seems to demonstrate that the cartilage-like tissue was strong enough to be transferred after being implanted for 8 weeks.

6、The cartilage-like tissue was proved to be tissue-engineered hyaline cartilage by HE stain. The chondrocytes could secrete chondroitin sulfate as proved by Lev-Spicer stain. Conclusion Tissue engineering technique was used to make tissue-engineered cartilage in vitro. It will provide a new transplan

7、t material for the repair of tissue or organ defects.【Key words】 Chondrocyte Guided tissue regeneration Culture in vitro Tissue engineering組織移植是整形外科修復(fù)和改善缺損組織器官的主要方法之一，但是，自體組織移植來(lái)源有限，免疫排斥和免疫抑制劑的副作用限制了異體組織的使用，其它合成及天然材料亦存有各種不足。80年代初組織工程學(xué)的開(kāi)展，為尋求新的組織移植替代物開(kāi)辟了新途徑。我們也嘗試?yán)媒M織工程技術(shù)，進(jìn)行組織工程軟骨的培育，選擇細(xì)胞易分離、增殖能力強(qiáng)的新生牛透

8、明軟骨細(xì)胞，與醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜體外聯(lián)合培養(yǎng)后，植入裸鼠體內(nèi)，觀察探求用組織工程軟骨，解決整形外科領(lǐng)域移植材料不足的可能性。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.2實(shí)驗(yàn)方法16/ml，取1ml軟骨細(xì)胞懸浮液接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)的1cm×1cm醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜上，置37CO22結(jié)果2.1軟骨細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果以往軟骨組織工程學(xué)研究，廣泛使用的細(xì)胞培養(yǎng)支架為PGA，我們選用中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供的醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜代替PGA，加入細(xì)胞懸浮液后，鏡下觀察細(xì)胞均勻沉降于醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜表面，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。1周后醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜可見(jiàn)乳白色物質(zhì)。2.

9、2大體解剖觀察結(jié)果移植術(shù)后8周，裸鼠皮下可見(jiàn)約0.5cm×1.0 cm大小新生組織塊，觸之微軟有彈性，可隨皮膚上下左右移動(dòng)；解剖見(jiàn)新生組織塊為乳白色，組織表面有血管通過(guò)，觸之有彈性。2.3組織學(xué)觀察結(jié)果利用蘇木素-伊紅染色，可觀察到新生組織內(nèi)的基質(zhì)呈堿性，軟骨細(xì)胞核呈藍(lán)染。其中可見(jiàn)同源軟骨細(xì)胞，軟骨囊不明顯(1)。Lev-Spicer染色顯示了新生組織中呈藍(lán)染的部分區(qū)域(2)，表明軟骨細(xì)胞可以分泌硫酸軟骨素。1組織工程軟骨組織的蘇木素伊紅染色，其中可見(jiàn)同源軟骨細(xì)胞，軟骨囊不明顯×400Fig1Photomicrograph demonstration histology,u

10、sing hematoxylin and eosin stain,tissue-engineered cartilage.The specimen is composed chondrocytes and aldaline matrix.Nucli of the chondrocytes are stained in blue color and alkaline matric are stained in pink color×4002組織工程軟骨的阿爾新蘭染色，組織中呈藍(lán)染的部分為軟骨細(xì)胞分泌的硫酸軟骨素   ×400Fig2Lev-Spicer staini

11、ng of tissue-engineered cartilage.Chondroitin sulfate is stained in blue color×4003討論組織工程學(xué)的開(kāi)展，為研究修復(fù)組織和器官缺損所致的功能障礙開(kāi)辟了新途徑，自從Vacanti等2-4利用組織工程技術(shù)成功的再生了新生小牛透明軟骨后，組織工程學(xué)研究越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。國(guó)內(nèi)學(xué)者近年來(lái)從各個(gè)角度進(jìn)行了研究探討，劉彥春等5進(jìn)行了組織工程技術(shù)中細(xì)胞培養(yǎng)支架的研究，證實(shí)以卵磷脂和多聚賴氨酸共同包埋支架，使細(xì)胞均勻分布于支架纖維之間和支架表面，可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)揮正常功能。王為民等6進(jìn)行了用動(dòng)物組織的細(xì)胞外基質(zhì)(

12、Extracellular matrix, ECM)替代人工合成ECM制作的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)經(jīng)處理后的動(dòng)物組織僅剩肌腱、皮膚、軟骨和骨的膠原框架，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明兔軟骨ECM，可以作為組織填充物而長(zhǎng)期存在并有較好的組織親和性和相容性，可以在體內(nèi)誘導(dǎo)軟骨膜細(xì)胞向其中生長(zhǎng)而重建軟骨。張前法等7進(jìn)行了兔自體肌腱細(xì)胞與碳纖維體外聯(lián)合培養(yǎng)后的體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明體內(nèi)植入后肌腱細(xì)胞繼續(xù)增殖，并能合成I型膠原。軟骨組織是整形外科進(jìn)行組織修復(fù)與重建的理想材料，由于自體軟骨供區(qū)有限，因此，我們開(kāi)展軟骨組織工程學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究，選用中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供的醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜作為細(xì)胞外基質(zhì)，其主要材料為動(dòng)物天然膠原蛋白，具有組織細(xì)胞誘導(dǎo)再生作用，其特有的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有細(xì)胞網(wǎng)結(jié)聚集功能。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜可以作為軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)支架。將新生小牛肱骨關(guān)節(jié)面的透明軟骨細(xì)胞-組織引導(dǎo)再生膠原膜復(fù)合物，植入裸鼠體內(nèi)，8周后對(duì)從裸鼠體內(nèi)獲得組織工程軟骨樣組織進(jìn)行的組織學(xué)檢測(cè)，證實(shí)為