血小板膜糖蛋白Ⅵ（GPⅥ）的研究進(jìn)展

1、血小板膜糖蛋白（GP）的研究進(jìn)展    【摘要】  血小板膜糖蛋白（ GP）是血小板表面重要的膠原受體，能介導(dǎo)血小板與膠原的初期黏附，產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高整合蛋白受體親合力，引起血小板聚集和血栓形成。抑制GP功能可顯著抑制膠原誘導(dǎo)的血小板黏附、聚集和血栓形成，故GP已成為研制新型抗血小板藥物的主要靶點(diǎn)。過(guò)去幾年中，對(duì)血小板和膠原相互作用的研究取得很大進(jìn)展,本文就GP的結(jié)構(gòu)，GP的功能，GP功能相關(guān)因素，GP與臨床等作一綜述。 【關(guān)鍵詞】  血小板膜糖蛋白； 膠原； 血栓形成Advances in the Studies of plate

2、let glycoprotein （ GP） ReviewAbstractplatelet glycoprotein （ GP）  is a major receptor for collagen on the platelet surface. It mediates the initial platelet contact with collagen, generates intracellular signals, increases the affinity of integrin receptor, and causes platelet aggregation and t

3、hrombosis. Suppression of GP function can signicantly inhibit collagen-induced platelet adhesion, aggregation and thrombosis, so  GP has become  a novel target for antiplatelet therapy. Within the last few years, major advances have been made in understanding platelet-collagen interactions

4、.  In this paper, the advances of study on GP, including composition of GP, functions of GP, factors related with functions  of GP, GP  and clinic  were summarized.Key wordsGP; collagen; thrombosis血小板與血管損傷部位暴露的細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，  ECM） 接觸是形成血栓、修復(fù)損傷組織和止血的第一道防線(xiàn)。 在ECM的

5、大分子組成成分中膠原起主要作用,它不但可以通過(guò)直接和間接的途徑與血小板黏附，還可引起血小板聚集及促凝活性的表達(dá),在存在高切應(yīng)力的動(dòng)脈或損傷血管處血小板與膠原的相互作用尤為重要。目前研究認(rèn)為，血小板表面有兩類(lèi)膠原受體即整合蛋白21(GPa/a)和血小板膜糖蛋白（GP）。21可直接與膠原結(jié)合,但需要經(jīng)過(guò)由內(nèi)向外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力狀態(tài)才能實(shí)現(xiàn)，而GP在介導(dǎo)血小板與膠原黏附、快速信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血小板活化及促凝活性表達(dá)等復(fù)雜過(guò)程中處中心位置1。近年來(lái)對(duì)GP的研究取得很大進(jìn)展，現(xiàn)綜述如下。GP的結(jié)構(gòu)1982年, 應(yīng)用2-D凝膠電泳，GP首次被確認(rèn)。1999年，Clemetson等2首先報(bào)道人GP克隆為型

6、單鏈跨膜糖蛋白,屬免疫球蛋白超家族成員。GP基因定位于19號(hào)染色體長(zhǎng)臂(19q13.4)，含有8個(gè)外顯子，分子量為62 kD，其cDNA克隆全長(zhǎng)1 017 bp,編碼319個(gè)氨基酸殘基和20個(gè)氨基酸信號(hào)肽，分子結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)有2個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和含多個(gè)O糖基化位點(diǎn)的黏蛋白樣富含絲蘇氨酸區(qū)域，為分子的空間活動(dòng)提供一定的柔韌度；位于GP跨膜區(qū)19個(gè)氨基酸中第3位帶正電荷的精氨酸與免疫球蛋白Fc受體鏈跨膜區(qū)的天門(mén)冬氨酸殘基以鹽鍵相連，組成受體復(fù)合物；胞內(nèi)區(qū)含51個(gè)氨基酸，不含酪氨酸殘基，但含有2個(gè)獨(dú)特序列，一是靠近跨膜區(qū)富含堿性氨基酸的區(qū)域，能與鈣調(diào)蛋白結(jié)合；另一個(gè)是位于

7、中部的富含脯氨酸基序，可選擇性與Src家族酪氨酸激酶Fyn 和Lyn 的SH3區(qū)結(jié)合3。GP的功能GP介導(dǎo)血小板與膠原的初期黏附，產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高整合蛋白受體親合力，引起血小板聚集、釋放和血栓形成4。膠原、合成膠原及GP特異性配體在人類(lèi)基因組上，有20余種膠原基因，其中9種被證實(shí)表達(dá)于血管壁上，纖維膠原、型是血管壁ECM的重要組成成分，而型網(wǎng)狀膠原是內(nèi)皮細(xì)胞基底膜的組成形式。血小板可被不溶性纖維膠原激活，可溶性膠原不結(jié)合靜止?fàn)顟B(tài)的血小板，而與另一膠原受體，活化的整合蛋白21結(jié)合，它只有轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維膠原時(shí)才能激活血小板5。膠原含有重復(fù)的GPO基序（G，甘氨酸；P，脯氨酸；O，羥脯氨酸），約占、型

8、膠原的10，是血小板與ECM接觸的重要結(jié)構(gòu)形式，也是與GP免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合基序。膠原相關(guān)肽（collagen-related peptide， CRP）是含有串聯(lián)的GPO基序的人工合成肽段，是GP的誘導(dǎo)劑。許多蛇毒肽可通過(guò)GP發(fā)揮作用，其中C型凝集素convulxin是最早被證實(shí)的，它通過(guò)使受體叢集誘導(dǎo)血小板活化。GP與免疫球蛋白Fc受體鏈復(fù)合物Jarvis等6發(fā)現(xiàn)，缺乏FcR鏈的血小板對(duì)膠原的刺激無(wú)反應(yīng)，提示GP和FcR鏈以非共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白復(fù)合物是所有類(lèi)型膠原的關(guān)鍵受體，兩者在結(jié)構(gòu)和功能上密切相關(guān)。Yoshiki等7 也實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GP只有和FcR鏈組成異源二聚體，才能與膠原結(jié)合，而

9、且只結(jié)合不溶性纖維膠原。FcR鏈含有免疫受體酪氨酸活化基序（immuno receptor tyrosine based activation motif， ITAM），是該復(fù)合物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)部分。GP與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)膠原通過(guò)其特異性GPO序列與GPFcR鏈?zhǔn)荏w復(fù)合物結(jié)合后，使2個(gè)GP復(fù)合物交聯(lián)而活化。GP胞內(nèi)富含脯氨酸的基序選擇性與Src家族酪氨酸激酶Fyn 和Lyn 的SH3區(qū)結(jié)合，使FcR鏈的ITAM磷酸化，ITAM磷酸化為Syk家族酪氨酸激酶提供了結(jié)合位點(diǎn)，可特異結(jié)合在其串聯(lián)的SH2區(qū)而使Syk酪氨酸磷酸化。擁有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的Syk底物，接頭蛋白LAT和SLP-76等可募集其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體

10、，引發(fā)下游許多效應(yīng)酶包括磷脂酰C2, 小G蛋白和磷脂酰肌醇3激酶等活化，從而使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)擴(kuò)大，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度升高，纖維蛋白原受體活化，細(xì)胞骨架重排，最終血小板發(fā)生聚集、釋放和促凝活性表達(dá)。GP在體內(nèi)分布有明顯的空間限制性,僅分布于巨核細(xì)胞和血小板,在其他組織細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá),被認(rèn)為是血小板膠原特異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。GP基因剔除小鼠血小板表現(xiàn)出對(duì)膠原刺激無(wú)反應(yīng)，但無(wú)明顯出血傾向8。GP功能相關(guān)的影響因素整合蛋白21的作用整合蛋白21（也被稱(chēng)作為GPa/a或淋巴細(xì)胞VLA-2）是血小板上第一個(gè)被確認(rèn)的膠原受體，依賴(lài)于Mg2+與膠原結(jié)合，但不能誘導(dǎo)酪氨酸激酶活化。GFOGER序列是21特異性螺旋肽，

11、支持21介導(dǎo)的黏附9。21在體內(nèi)多種組織上表達(dá)，是膠原和層黏連蛋白的受體，但在血小板上只和膠原結(jié)合。上個(gè)世紀(jì)80年代后期及90年代早期，21被認(rèn)為是血小板表面最主要的膠原受體，在血小板與膠原的黏附、活化中起關(guān)鍵作用，但后來(lái)對(duì)21作用的研究出現(xiàn)爭(zhēng)議。Jung和 Moroi10的研究認(rèn)為，整合蛋白與膠原的親合力受細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的調(diào)整，即GP介導(dǎo)與膠原最初的結(jié)合，導(dǎo)致整合蛋白21和b3的活化，反過(guò)來(lái)它們又介導(dǎo)了與膠原的穩(wěn)定結(jié)合并加強(qiáng)了GP的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但另有研究證實(shí)21在血小板與膠原的最初黏附中起著重要作用11。Auger等12應(yīng)用特異性抗21和GP抗體以及Src家族酪氨酸激酶抑制劑研究發(fā)現(xiàn)，21和GP是

12、通過(guò)不同途徑介導(dǎo)血小板與膠原的結(jié)合，提示這兩種膠原受體可能相互協(xié)作增加血小板與膠原的結(jié)合而刺激血小板活化。最近，Sarratt等13應(yīng)用藥理學(xué)和基因?qū)W方法研究證實(shí)，21和GP這兩個(gè)結(jié)構(gòu)各異的膠原受體在血小板與膠原的結(jié)合中發(fā)揮同等重要的作用，都能產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致血小板聚集，并且兩者有密切的合作關(guān)系。GPb-復(fù)合體的作用內(nèi)皮下膠原最初俘獲血小板需要血漿蛋白vWF，它能同時(shí)結(jié)合膠原和GPb-。vWF依賴(lài)的膠原結(jié)合作用可快速終止，使血小板僅在vWF表面滾動(dòng)但不能形成穩(wěn)定的血栓，這種結(jié)合能被膠原和膠原受體更穩(wěn)定的結(jié)合而取代。vWF和GPb-結(jié)合后刺激鈣的動(dòng)員和細(xì)胞骨架重排，上調(diào)b3親合力，使其與

13、VWF結(jié)合，增加黏附，結(jié)合纖維蛋白原而形成血栓。vWF和GPb-結(jié)合后也可刺激血小板信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起血小板顆粒釋放，上調(diào)整合蛋白親合力，其具體途徑可能類(lèi)似于GP在血小板內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。GPb-和GP兩者的關(guān)系一般認(rèn)為，在低切應(yīng)力狀態(tài)下，GP啟動(dòng)血小板聚集，而GPb-復(fù)合物則引發(fā)高切應(yīng)力條件下的血小板聚集。但最近對(duì)GPb-及GP功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究顯示兩者有許多共同特征，從而推測(cè)它們?cè)诩?xì)胞表面可能相互關(guān)聯(lián)14。Arthur等15最近也研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用GPb特異性單克隆抗體SZ2，可明顯阻斷GP特異性誘聚劑CRP所誘導(dǎo)的血小板聚集，并證實(shí)在靜止和活化的血小板表面，GP和GPb-復(fù)合物均存在相互作用。b3

14、（GPb/a）的作用b3作為纖維蛋白原受體是血小板血栓形成的最后步驟。當(dāng)血管壁受損暴露血管內(nèi)皮下基質(zhì),血小板通過(guò)GPb及GP介導(dǎo)黏附于內(nèi)皮下膠原組織,黏附的血小板隨后發(fā)生一系列反應(yīng),包括花生四烯酸代謝,產(chǎn)生血栓烷A2和釋放細(xì)胞顆粒內(nèi)容物ADP等,導(dǎo)致b3復(fù)合物構(gòu)型改變和纖維蛋白原受體的暴露,并通過(guò)與纖維蛋白原的結(jié)合而使血小板之間相互黏附、聚集成團(tuán),在血管破損處形成血栓。b3由內(nèi)向外的活化依賴(lài)于鈣離子而b3與配體結(jié)合后還會(huì)產(chǎn)生由外向內(nèi)的信號(hào)傳遞引起血小板的第二次活化反應(yīng)，促進(jìn)顆粒釋放，以正反饋增強(qiáng)活化過(guò)程；同時(shí)，血小板膜磷脂的翻轉(zhuǎn)促進(jìn)了血液的凝固過(guò)程16。百事通 第二介質(zhì)在膠原引發(fā)血小板聚集的作

15、用細(xì)胞活化是血小板與膠原黏附的必要條件, GP在此過(guò)程中起主要作用,但是 GP介導(dǎo)的活化可被ADP和血栓烷等第二介質(zhì)強(qiáng)化。這些可溶性活化誘導(dǎo)劑激活血小板并非與膠原直接接觸，而是通過(guò)激活血小板上黏附膠原的整合蛋白21和b3，促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究證明ADP是通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)的受體P2Y1和P2Y12激活血小板，當(dāng)血小板被其他的誘聚劑激活，致密顆粒分泌A(yíng)DP作用于P2Y1P2Y12受體以自分泌和旁分泌機(jī)制促進(jìn)血小板穩(wěn)定聚集，這個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑協(xié)同GP信號(hào)促進(jìn)整合蛋白活化。P2Y1偶聯(lián)于Gq，調(diào)節(jié)鈣依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起血小板形狀改變和快速、可逆的b3依賴(lài)性血小板聚集；P2Y12偶聯(lián)于Gi通過(guò)抑制腺苷酸環(huán)化

16、酶產(chǎn)生cAMP來(lái)激活b3，這兩個(gè)受體的相互關(guān)系是P2Y1啟動(dòng)聚集，P2Y12起加強(qiáng)作用17。當(dāng)血小板通過(guò)21途徑結(jié)合膠原時(shí)，并不依賴(lài)于A(yíng)DP和血栓烷等介質(zhì)18。GP活化途徑的負(fù)性調(diào)節(jié)因子血小板活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能被血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule 1, PECAM-1）抑制19。表達(dá)于血細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的PECAM-1(也稱(chēng)為CD31)參與白細(xì)胞跨膜遷移，調(diào)節(jié)細(xì)胞活化及凋亡等多個(gè)過(guò)程。當(dāng)PECAM-1被激活后，通過(guò)Src家族酪氨酸激酶使其免疫受體酪氨酸抑制基序（immuno receptor tyrosine based

17、 inhibition motif， ITIM）磷酸化，募集酪氨酸、絲氨酸蘇氨酸或磷酯酶，隨后抑制激酶依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。黏附受體的活化信號(hào)及PECAM-1抑制信號(hào)的平衡可調(diào)整血栓形成的刺激閾值，決定血栓大小和穩(wěn)定度，防止血栓形成失控。其他有爭(zhēng)議的膠原受體CD36（或GP）在上個(gè)世紀(jì)80年代晚期被認(rèn)為是膠原受體，近來(lái)認(rèn)為它是型膠原的特異性受體而非膠原的功能性受體，因?yàn)槿狈D36的人或鼠，血小板對(duì)型膠原的反應(yīng)均正常6。另一個(gè)膠原受體是GP，它以非共價(jià)鍵與GPb/相連，但其功能卻不甚明了，不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大1，所以是否真正存在第三個(gè)功能性的膠原受體尚存在爭(zhēng)議。   

18、 綜上所述，血小板與膠原的黏附模式為：循環(huán)血流中血小板黏附到受損血管壁的第一步是vWF分子的A3區(qū)與暴露的膠原結(jié)合，vWF分子的A1區(qū)發(fā)生構(gòu)象的改變，而與血小板GP-復(fù)合物結(jié)合，使血小板間接黏附于膠原纖維，同時(shí)GP介導(dǎo)血小板與膠原直接結(jié)合；第二步，GP膠原的相互作用產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號(hào)將1、3整合蛋白轉(zhuǎn)為高親合力狀態(tài)，并誘發(fā)可溶性誘導(dǎo)劑的釋放（主要是ADP和血栓素）放大整合蛋白的活化，通過(guò)活化更多的血小板而介導(dǎo)血栓形成20。GPb介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可放大GP誘發(fā)的活化信號(hào)；最后，血小板通過(guò)活化的整合蛋白21（直接作用）和b3（通過(guò)vWF或其他配體間接作用）與膠原牢固黏附。整合蛋白介導(dǎo)的黏附加強(qiáng)了GP與膠

19、原的相互作用，引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加，更上調(diào)整合蛋白活性，增加釋放和促凝活性的表達(dá)，最終導(dǎo)致血栓形成。GP與臨床GP在止血和血栓中的臨床意義盡管細(xì)胞外基質(zhì)成分復(fù)雜，但血小板和膠原的黏附在體內(nèi)啟動(dòng)止血和血栓起重要作用。抑制GP功能可在體外高切應(yīng)力下顯著抑制膠原誘導(dǎo)的血小板黏附、聚集和血小板血栓形成21。GP缺乏最重要的特點(diǎn)是患者血小板對(duì)膠原誘導(dǎo)的聚集無(wú)反應(yīng)，但對(duì)其他誘聚劑反應(yīng)正常。Boylan等22報(bào)道在一例ITP患者血漿中檢測(cè)到抗GP自身抗體，雖然其GP基因正常，但血小板表面GP和FcR鏈幾乎喪失，證實(shí)是其自身抗體特異性結(jié)合GP陽(yáng)性血小板，清除血漿中可溶性GP，導(dǎo)致血小板不能結(jié)合膠原，也不能形成血栓

20、。Samaha等23用流式細(xì)胞技術(shù)直接測(cè)定血小板表面的膠原受體密度，發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者受體密度較正常對(duì)照增高，提示血小板膠原受體密度增高可能是心肌梗死患者新的危險(xiǎn)因素。Bellucci等24報(bào)道2例惡性血液病患者膠原誘導(dǎo)的血小板功能障礙是由于GP偶聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損。Nurden等25報(bào)道1例灰色血小板綜合癥患者伴有獲得性GP缺乏，其膠原誘導(dǎo)的血小板聚集功能受損。新型抗血小板藥物的研究進(jìn)展血栓栓塞性疾病是當(dāng)前危害人類(lèi)健康的主要原因之一,血小板異?；罨谘ㄐ纬芍衅鹬匾饔?因而研制開(kāi)發(fā)抑制血小板黏附、釋放、聚集功能和血小板活化的抗血小板藥物是抗血栓治療的一個(gè)重要策略。如抗血小板GPb/a單克隆

21、抗體阿昔單抗能有效預(yù)防冠狀動(dòng)脈閉塞患者溶栓治療和冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成型術(shù)后的冠狀動(dòng)脈再栓塞，但存在治療窗口狹小和并發(fā)出血等不良反應(yīng)。血小板與膠原之間的相互作用是血小板黏附、聚集和活化的始動(dòng)因素,因而成為研制新型抗血小板藥物的主要靶點(diǎn)26。在小鼠體內(nèi)動(dòng)脈損傷模型中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抗GP抗體處理的血小板不與損傷的動(dòng)脈內(nèi)膜發(fā)生黏附，也不在局部形成血栓27。體外試驗(yàn)也表明，抗小鼠GP單克隆抗體JAQ1對(duì)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集有一定的抑制效應(yīng)13，它可使循環(huán)血小板表面的GP內(nèi)化和降解,產(chǎn)生GP基因剔除樣現(xiàn)象，但不影響其他血小板受體如GPb/a、GPb/等, 表明JAQ1是特異性阻斷GP依賴(lài)性血小板活化通路。Qian等2

22、8應(yīng)用組合抗體文庫(kù)技術(shù)制備人源抗GP抗體,其中A10克隆可特異性抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集。Smethurst等29應(yīng)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選出抗GP ScFv抗體(10B12),可顯著抑制膠原與GP的結(jié)合。因GP僅在血小板和巨核細(xì)胞上表達(dá)，針對(duì)GP為靶點(diǎn)的抗體對(duì)抑制血小板活化具有特異性的阻斷作用,且GP缺乏患者僅表現(xiàn)為輕微的出血傾向，更容易耐受，故目前人們正積極尋找有效的GP拮抗劑，聯(lián)合不同作用機(jī)制的抗血小板藥物可能是抗栓治療的一個(gè)方向。結(jié)語(yǔ)近年來(lái)，對(duì)血小板及膠原相互作用以及在啟動(dòng)止血及血栓作用的研究取得很大進(jìn)展。GP作為主要的膠原受體參與血小板的初期黏附,并誘發(fā)一系列血小板由內(nèi)到外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),

23、活化血小板膜表面整合蛋白受體,導(dǎo)致血小板聚集和血小板血栓形成，故血小板GP結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)正常止血功能的發(fā)揮和動(dòng)脈血管內(nèi)高切應(yīng)力條件下的病理性血栓形成有重要影響。開(kāi)發(fā)GP高度特異性抑制劑對(duì)基礎(chǔ)研究很有價(jià)值并具有臨床應(yīng)用潛力?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Nieswandt B, Watson SP. Platelet-collagen interaction: is GP the central receptor? Blood, 2003; 102: 449-4612 Clemetson JM, Polgar J, Magnenat E, et al. The platelet colla

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