花生NAC轉(zhuǎn)錄因子的克隆及轉(zhuǎn)錄特征

1、作物學(xué)報(bào) ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(3: 541 545 /zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw 本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (30771297, 廣東省自然科學(xué)基金 (06025049, 廣東省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目 (C10033資助。*通訊作者 (Corresponding author: 李玲 , Tel: E-mail: lilab第一作者聯(lián)系方式 : E-mail: liu5210500Received(收稿日期

2、: 2008-08-20; Accepted(接受日期 : 2008-10-06.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00541花生 NAC 轉(zhuǎn)錄因子 AhNAC2和 AhNAC3的克隆及轉(zhuǎn)錄特征劉 旭 李 玲 *華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 , 廣東廣州 510631摘 要 : NAC 轉(zhuǎn)錄因子是特異存在于植物中具有多種生物功能的新型轉(zhuǎn)錄因子。 本實(shí)驗(yàn)從花生中克隆了 2個(gè) NAC 基 因 AhNAC2和 AhNAC3(GenBank登錄號(hào)為 EU755023和 EU755022; 蛋白序列分析表明 , 兩者具有典型 NAC 轉(zhuǎn)錄因 子特征

3、 , N端含有保守 NAC 結(jié)構(gòu)域。半定量 RT-PCR 顯示 , 在 ABA 和 GA 3處理 , 以及控水和低溫條件下 , AhNAC2和 AhNAC3在花生組織中的表達(dá)上調(diào) , 呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。 AhNAC2和 AhNAC3為典型的 NAC 轉(zhuǎn)錄因子新基因 , 蛋 白序列與擬南芥 RD26同源性較高 , 推測(cè)與響應(yīng)干旱和 ABA 信號(hào)有關(guān)。 關(guān)鍵詞 : NAC 轉(zhuǎn)錄因子; 基因表達(dá)調(diào)控; 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)Cloning and Characterization of the NAC-Like Gene AhNAC2 and AhNAC3 in PeanutLIU Xu and LI Ling

4、*Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, ChinaAbstract: NAC transcription factors existed differentially in plant are the new transcription regulatory factors with multiple bio-logical functions. Two N

5、AC-like genes from peanut were cloned by RT-PCR and RACE methods, named AhNAC2 and AhNAC3 (GenBank accession No. EU755023 and EU755022, which contain an ORF of 1 050 bp and 1 008 bp and encode 349 and 335 amino acids, respectively. Gene sequence analysis showed that the putative protein of both two

6、genes contained conserved NAC domain and highly different C terminal which is the typical characteristics of NAC transcription factors. Meanwhile, the transcrip-tion levels of the two genes were investigated by semi-quantitative RT-PCR, and the result showed that the expressions of Ah-NAC2 and AhNAC

7、3 genes were enhanced by ABA, GA3, water stress, and cold stress respectively. Furthermore, the two genes expressed constitutively in peanut tissues, and their expression patterns were different in various tissues. In conclusion, AhNAC2 and AhNAC3 genes isolated from peanut were new members of NAC t

8、ranscription factor family, their comparison to RD26 (AT4G27410 reveals a high amino acid homology. We suggested that they play key roles in ABA signal transduction and drought response in peanut.Keywords: NAC transcription factor; Gene expression and regulation; Signal transduction花生各個(gè)發(fā)育期的植株對(duì)水分和溫度的

9、需求不同 , 特別在開花下針期、 結(jié)莢期和飽果成熟期對(duì)高溫和缺水十 分敏感 , 干旱已成為影響花生經(jīng)濟(jì)重要因素 1-2。高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆響應(yīng)都通過(guò)其轉(zhuǎn)錄因子 調(diào)控目的基因表達(dá) 3。 NAC 轉(zhuǎn)錄因子是特異存在于植物 中具有多種生物功能的一類新型轉(zhuǎn)錄因子 4。 NAC 蛋白 家族成員 N 端含有保守 NAC 結(jié)構(gòu)域 , 可結(jié)合 DNA 和其 他蛋白 5, C端為高度變異的轉(zhuǎn)錄激活區(qū) 6。 目前在十多種 植物中發(fā)現(xiàn) NAC 基因 , 功能涉及植物體生長(zhǎng)發(fā)育、激素 調(diào)控、脅迫響應(yīng)等重要方面 4。 NAC 家族成員眾多 , 擬南芥 NAC 轉(zhuǎn)錄因子 ATAF1的表達(dá)受干旱和 ABA 處理誘導(dǎo)

10、, 負(fù)調(diào)控滲透脅迫反應(yīng) 7。 過(guò)表達(dá) NAC 基因 (SNAC1 的水稻 抗旱性增強(qiáng) 8。冷和鹽脅迫誘導(dǎo)水稻 SNAC2基因表達(dá) , 其 轉(zhuǎn)基因植株顯著提高對(duì)冷和鹽脅迫的抗性 9。擬南芥中 3個(gè) NAC 基因 (ANAC019、 ANAC055和 ANAC072 的過(guò)表達(dá) 顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐旱能力 10, ANAC072 (RD26 參 與 ABA 的信號(hào)途徑 , 其過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)植株對(duì) ABA 的敏 感性 11。目前對(duì)作物的 NAC 基因研究較少 , 本試驗(yàn)從花生中 克隆到 2個(gè) NAC 新基因 AhNAC2和 AhNAC3, 分析其序542作 物 學(xué) 報(bào) 第 35卷列特征和表達(dá)特性 ,

11、 為探討 NAC 基因在 ABA 提高花生抗 旱性中的功能提供基礎(chǔ)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料花生粵油 7號(hào)為耐旱品種 , 由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物 研究所提供。1.2cDNA 克隆與序列分析根據(jù)已報(bào)道的植物 NAC 基因保守區(qū)序列 , 設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并 引物 NAC-L1、 NAC-R1和 NAC-R2 (表 1, 提取葉片總 RNA, 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA, PCR擴(kuò)增目的片段 ; 以引物 3' RACE-T 逆 轉(zhuǎn) 錄 得 cDNA 模 板 , 分 別 用 NAC2-L1、 NAC2-L2、 NAC3-L1 和 NAC3-L2(表 1 與 3' 接頭引物 3' RACE-R

12、進(jìn)行槽式 PCR 擴(kuò)增 3' cDNA末端片段 ; 利用 NAC2-R1、 NAC2-R2、 NAC3-R1和 NAC3-R2分別與 5' RACE Outer Primer(5' ROP和 5' Race Inner Primer(5' RIP (表 1 擴(kuò)增 5' cDNA末端片段。 設(shè)計(jì)引物 NAC2-F 、 NAC3-F 和 NAC2-R 、 NAC3-R(表 1 進(jìn)行 PCR, 獲得中間未知序列。 通過(guò)軟件整合測(cè)序結(jié)果 , 基于 NCBI 的 Blast 和 GenBank (/BLA

13、ST進(jìn)行序列對(duì)比 , 采用 Bannai 等 12的 iPSORT 運(yùn)算法則預(yù)測(cè)核定位序列 ; 使用 DNAMAN 和 DNAStar 等分析基因的預(yù)測(cè)蛋白讀碼框 (ORF、分子量、親 /疏水性 , 并建立相關(guān) NAC 蛋白系統(tǒng) 進(jìn)化樹。表 1克隆 NAC 基因中所用引物序列 Table 1 Primers used in isolating NAC genes引物名稱 Primer引物序列Primer sequence (5'3'引物名稱Primer引物序列Primer sequence (5'3'NAC-L1 AANGGNGGNCCNAARKCTAARRTA

14、 NAC4-F GAAGAGGAGATTTACTACGGTCTGANAC-R1 GARTGGTAYTTYTTYWSNCCNAG NAC4-R GTACAAAACGTGATTCATGTGGCTCANAC-R2 RACNARRGCTTTCTTRATNCC NAC3-F CAGAGGAAGGAAAAGAGTTCAAGAANAC2-L1 GAATGGTACTTCTTTAGTCCGAGGGA NAC3-R CACAAGGCCTTGACAATGACAATGCANAC2-L2 GCTCTGGTTTTCTACATTGGTAAGG 3'RACE-R GACTCGAGTCGACATCGNAC3-L1 CT

15、GGCAACCATTTCTCACTTCCTAT 3'RACE-T GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT NAC3-L2 CACTACCGAAGGCAGAAAAGTTGGA 5'ROP CATGGCTACATGCTGACAGCCTA5'RIPCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG 引物序列中 N 代表 A 或 G, R代表 C 或 T, K代表 T 或 G, W代表 A 或 T 。 5' RACE Outer Primer (5' ROP和 5' RACE Inner Primer (

16、5' RIP 由 TaKaRa 公司 5'RACE 試劑盒提供。N: A or G, R: C or T, K: T or G, W: A or T in primer sequence. 5' RACE Outer Primer (5' ROP and 5' RACE inner Primer (5' RIP produced by TaKaRa company.1.3植物激素和脅迫處理三葉期幼苗分別在含 100 µmol L1ABA(脫落酸 、 20 µmol L1GA 3(赤霉素 和 20 µmol L1 6-

17、BA(細(xì)胞分裂素 的 MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在不加任何激素的 MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的 植株為對(duì)照。按 Wan 和 Li 13的方法對(duì)三葉期幼苗進(jìn)行控水處理 0、 1、 2、 4和 6 h, 高鹽處理 (含 250 µmol L1NaCl 的 MS 溶 液 0、 12和 24 h和低溫處理 (4培養(yǎng) 0、 12和 24 h, 對(duì) 照 (CK為 MS 0培養(yǎng)基培養(yǎng)的植株。1.4半定量 RT-PCR 分析基因轉(zhuǎn)錄水平的變化取等量 RNA 為模板 , 以花生 18S rRNA基因 14為內(nèi) 參 (18S-F: 5'-ATT CCT AGT AAG CGC GAG TCA TCA G-3&#

18、39; 和 18S-R: 5'-CAA TGA TCC TTC CGC AGG TTC AC-3' 。 利 用 非 編 碼 區(qū) 特 異 引 物 NAC3-F 、 NAC3-R 、 NAC4-F 、 NAC4-R(表 1 進(jìn)行 One Step RT-PCR擴(kuò)增。預(yù) 實(shí)驗(yàn)確定 PCR 循環(huán)數(shù)為 28個(gè) (內(nèi)參基因 15個(gè) 。 用半定量 RT-PCR 檢測(cè)不同處理和組織的基因轉(zhuǎn)錄水平。2結(jié)果與分析2.1NAC 基因的克隆和序列分析克隆的花生 AhNAC2和 AhNAC3, cDNA序列全長(zhǎng)分 別為 1 565 bp和 1 276 bp, 開放讀碼框?yàn)?1 050 bp和 1 008

19、 bp, 分別編碼 349和 335個(gè)氨基酸殘基 , 相對(duì)分子量為 39.1 kD和 37.7 kD, 蛋白等電點(diǎn)分別為 7.38和 6.36。 生物 信息學(xué)分析表明 , 兩基因 N 端大約 180個(gè)殘基區(qū)域含有 NAC 結(jié)構(gòu)域 , 包括 5個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域和核定位序列 (圖 1和圖 2, 蛋白 C 端高度變異。 AhNAC2與大豆 GmNAC4和 擬 南 芥 ANAC072的 同 源 性 分 別 為 82.4%和 71.1%, AhNAC3與 GmNAC3和 ANAC072的同源性分別為 76.6%和 68.7%。 系統(tǒng)進(jìn)化分析表明 (圖 3, 兩基因與擬南芥中的 ANAC072 (RD26

20、 及大豆的 GmNAC3和 GmNAC4的親緣 關(guān)系較近。兩個(gè)基因的 cDNA 序列 2007年已在 GenBank 上注冊(cè) , 登錄號(hào)分別為 EU755023和 EU755022。 2.2AhNAC2和 AhNAC3在花生組織的表達(dá)圖 4表明 , 在成熟葉、幼葉、根、莢果和未成熟種子 中皆有 AhNAC2和 AhNAC3表達(dá) , 其中 , AhNAC2在幼葉、 根、 莢果和未成熟種子中的表達(dá)量高 , 在成熟葉的表達(dá)較 弱。 AhNAC3在葉片表達(dá)量較高。2.3植物激素對(duì) AhNAC2和 AhNAC3表達(dá)的影響ABA 增加 AhNAC2和 AhNAC3表達(dá) (圖 5, 處理 12 h后 , A

21、hNAC2表達(dá)量高于 AhNAC3, 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng) ,第 3期 劉 旭等 : 花生 NAC 轉(zhuǎn)錄因子 AhNAC2和 AhNAC3的克隆及轉(zhuǎn)錄特征 543 圖 1AhNAC2和 AhNAC3的核苷酸序列預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of AhNAC2 (A and AhNAC3 (B黑色方框部分為保守的 NAC 結(jié)構(gòu)域 ; 紅色下劃線部分代表預(yù)測(cè)的核定位信號(hào) (NLS。The conserved NAC domain of NAC gene is in black boxes; the two red

22、 underline sequences are putative nuclear localization signal. 圖 2AhNAC2和 AhNAC3與其他 NAC 蛋白的 NAC 結(jié)構(gòu)域比對(duì)Fig. 2 Comparison of NAC domain alignments between AhNAC2, AhNAC3 and some other NAC proteinsA 、 B 、 C 、 D 、 E 的黑框分別代表 NAC 結(jié)構(gòu)域中 5個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域。Conserved subdomains A to E are shown by black frame in the N

23、AC domain.544作 物 學(xué) 報(bào) 第 35卷 圖 3AhNAC2和 AhNAC3與其他 NAC 蛋白系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig. 3 Phylogentic tree of AhNAC2, AhNAC3 and some other NAC proteins水稻 OsNAC1和 OsNAC3基因的 NCBI 登錄號(hào)分別為 AB028180和 AB028182; 擬南芥 ANAC072/RD26和 ANAC002/ATAF1基因的 NCBI 登錄 號(hào)分別為 AT4G27410和 AT1G01720; ANAC018/NAM、 ANAC091/TIP、 ANAC022/NAC1、 ANAC098/

24、CUC2、 ANAC068/NTM1、 ANAC029/NAP基 因的 NCBI 登錄號(hào)分別為 AT1G52880、 AT5G24590、 AT1G56010、 AT5G53950、 AT4G01540和 AT1G69490;大豆 GmNAC3和 GmNAC4基因的 NCBI 登錄號(hào)分別為 DQ028771和 DQ028772; AhNAC1基因的 NCBI 登錄號(hào)為 EU669863。The above proteins include OsNAC1 (AB028180 and OsNAC3 (AB028182 in rice; ANAC072/RD26 (AT4G27410, ANAC00

25、2/ATAF1 (AT1G01720, ANAC018/NAM (AT1G52880, ANAC091/TIP (AT5G24590, ANAC022/NAC1 (AT1G56010, ANAC098/CUC2 (AT5G53950, ANAC068/NTM1 (AT4G01540 and ANAC029/NAP (AT1G69490 in Arabidopsis thaliana; GmNAC3 (DQ028771 and GmNAC4 (DQ028772 in soybean; AhNAC1 (EU669863 in peanut.AhNAC2和 AhNAC3轉(zhuǎn)錄水平不斷增強(qiáng) , 24 h

26、后兩者之間 差異不明顯 ; GA促進(jìn) AhNAC2和 AhNAC3表達(dá) (圖 5, 處 理時(shí)間延長(zhǎng) , 轉(zhuǎn)錄水平不斷增強(qiáng) , AhNAC2在處理 36 h之 間表達(dá)量變化小 , 624 h間變化較大 ; 6-BA處理 3 h的葉 片 , 2個(gè)基因表達(dá)提高 , 處理 6 h后轉(zhuǎn)錄水平降低 , 12 h表 達(dá)量又升高 , AhNAC3在 12 h和 24 h的表達(dá)量高于 AhNAC2(圖 5 。2.4控水、 高鹽和低溫對(duì) AhNAC2和 AhNAC3轉(zhuǎn)錄水平 的影響控 水 處 理 1 h后 , 花 生 根 和 葉 片 中 AhNAC2和 AhNAC3的表達(dá)上升 , 根中 AhNAC2的表達(dá)高于 A

27、hNAC3, 兩基因表達(dá)量隨控水時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加 , 兩者間差異不 明顯 ; 與對(duì)照相比 , 4處理使 AhNAC2和 AhNAC3表達(dá)均 上調(diào) ; 250 µmol L 1 NaCl的處理對(duì) AhNAC2和 AhNAC3表 達(dá)影響不明顯 (圖 6 。3討論NAC 轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)控和環(huán)境 脅迫的應(yīng)答 , 是一類調(diào)節(jié)植物體內(nèi)各種生理反應(yīng)的關(guān)鍵 圖 4RT-PCR 分析 AhNAC2和 AhNAC3在花生組織中的表達(dá) Fig. 4 Tissue specific expression of AhNAC2 and AhNAC3 in peanut by RT-PCRYL:

28、 幼葉 ; OL: 成熟葉 ; R: 根 ; IS: 未成熟種子 ; P: 莢果。 YL: young leaf; OL: mature leaf; R: root; IS: immature seeds; P: pods. 圖 5不同激素處理對(duì) AhNAC2和 AhNAC3的影響Fig. 5 Effects of different phytohormones on AhNAC2 and AhNAC3 expressions第 3期 劉 旭等 : 花生 NAC 轉(zhuǎn)錄因子 AhNAC2和 AhNAC3的克隆及轉(zhuǎn)錄特征 545 圖 6控水、高鹽和低溫條件下 AhNAC2和 AhNAC3表達(dá)Fig

29、. 6 Expression patterns of AhNAC2 and AhNAC3 under water, high salt, and cold stresses因子。本文首次報(bào)道兩個(gè)花生 NAC 轉(zhuǎn)錄因子 AhNAC2和 AhNAC3, 其結(jié)構(gòu)上均有植物 NAC 轉(zhuǎn)錄因子典型的特征 , 如蛋白 N 端保守 , C端存在高度多變且頻繁出現(xiàn)簡(jiǎn)單重復(fù) 氨基酸的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。 AhNAC2和 AhNAC3與擬南芥 ANAC072(RD26及大豆 GmNAC3和 GmNAC4親緣關(guān)系較 近 , 對(duì)后者的功能分析尚缺乏報(bào)道。已知 , RD26屬于 AtNAC3亞家族 15, 該亞家族的成 員多受

30、干旱和 ABA 誘導(dǎo)表達(dá) 10, RD26參與干旱和 ABA 的信號(hào)途徑 11, 由此推測(cè) AhNAC2和 AhNAC3可能具有 RD26類似功能 , 響應(yīng)干旱和 ABA 信號(hào)。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)控水 條件下和外源 ABA 處理 , 使花生 AhNAC2和 AhNAC3基 因表達(dá)上調(diào) ; AhNAC2和 AhNAC3在外源 GA 處理和冷脅 迫條件下表達(dá)也上調(diào) , 預(yù)示它們可能參與冷脅迫響應(yīng)和 GA 信號(hào) ; 但是 , 兩基因的表達(dá)在高鹽處理期間沒有明顯 變化。外源 6-BA 處理 012 h, 基因表達(dá)不穩(wěn)定。說(shuō)明 AhNAC2和 AhNAC3基因具有特殊作用 , 有待進(jìn)一步研究。 目前 , 大多

31、數(shù) NAC 轉(zhuǎn)錄因子的功能尚不清楚 , 分析 NAC 基因在植物中的表達(dá)模式 , 對(duì)于明確其功能 , 闡明 轉(zhuǎn)錄水平對(duì)植物激素調(diào)控及逆境脅迫的應(yīng)答機(jī)制具有重 要的意義。本結(jié)果表明 , AhNAC2和 AhNAC3基因可能是 組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子 , 存在不同的表達(dá)模式。 本實(shí)驗(yàn)室 正 在 開 展 其 轉(zhuǎn) 錄 活 性 和 轉(zhuǎn) 基 因 的 后 續(xù) 研 究 , 旨 在 探 討 NAC 基因在 ABA 提高花生抗旱性中的機(jī)制。References1 Giayetto O, Cerioni G A. Water stress in peanut (Arachis hypo-gaea L. J Peanu

32、t Sci, 2002, 31: 19232 Wang S-B(萬(wàn)書波 , Feng H-S(封海勝 , Zhang J-C(張建成 . National competition by building a strong peanut industry. J Peanut Sci (花生學(xué)報(bào) , 2003, (suppl: 510(in Chinese3 Singh K, Foley R C, Onate-Sanchez L. Transcription factors inplant defense and stress response. Curr Opin Plant Biol, 200

33、2, 5: 4304364 Liu Z-J(柳展基 , Shao F-X(邵鳳霞 , Tang G-Y(唐桂英 . The research progress of structure, function and regulation of plant NAC transcription factors. Acta Bot Boreal-Occident Sin (西北植 物學(xué)報(bào) , 2007, 27(9: 19151920(in Chinese with English ab-stract5 Ernst H A, Olsen A N, Larsen S, Lo Leggio L. Struc

34、ture of the conserved domain of ANAC, a member of the NAC family of transcription factors. EMBO Rep, 2004, 5: 2973036 Olsen A N, Ernst H A, Leggio L L, Skriver K. NAC transcription factors: Structurally distinct, functionally diverse. Trends Plant Sci , 2005, 10: 79877 Lu P L, Chen N Z, An R Su Z, Q

35、i B S, Ren F, Chen J, Wang X C. A novel drought-inducible gene, ATAF1, encodes a NAC family protein that negatively regulates the expression of stress-respon- sive genes in Arabidopsis. Plant Mol Biol, 2007, 63: 289305 8 Hu H H, Dai M Q, Yao J L Xiao B, Li X, Zhang Q, Xiong L. Overexpressing a NAM,

36、ATAF and CUC(NAC transcription fac-tor enhances drought resistance and salt tolerance in rice. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103: 12987129929 Hu H H, Jun Y, Yu J F Zhu X, Qi Z, Xiong L. Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salt toler-ance in rice. Plant Mol Biol, 2008, 67: 16918110 Tran L S, Nakashima K, Sakuma Y, Simpson S D, Fujita Y, Maruyama K, Fujita M, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi- Shinozaki K. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-ind